禽大腸桿菌的分離與耐藥性的檢測

王曉姍，李斯亮

(臨澤縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，甘肅 張掖 734200)

致病性大腸桿菌是人類和動物臨床上最常見的病原之一 ，是威脅人類和動物健康的重要致病菌。近些年，由于抗生素的濫用，細(xì)菌對藥物的耐藥性逐漸增加，并且大多數(shù)顯示出復(fù)雜的耐藥機(jī)制，尤其抗生素耐藥基因的出現(xiàn)更進(jìn)一步導(dǎo)致病菌的耐藥性的傳播和遺傳。禽大腸桿菌血清型 (群)比較復(fù)雜，且變異性較強(qiáng)，很難用疫苗得到有效的預(yù)防，并且對抗生素容易產(chǎn)生耐藥性，在臨床防治工作中，要取得較好的治療效果，就需要選擇對大腸桿菌比較敏感的藥物，來進(jìn)行預(yù)防與治療，才能達(dá)到控制該病的目的。本文針對這一方面作了有益的探討。

1 材料

1.1 病料來源

甘肅河西地區(qū)患有典型大腸桿菌病癥的雞，在其肝臟采取病料，并進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。本試驗采取了20株具有代表性的大腸桿菌病料作為試驗對象，并進(jìn)行進(jìn)一步鑒定和篩選。

1.2 主要試劑及材料

美蘭染色液、MR試劑、VP試劑、吲哚試劑、三糖鐵瓊脂粉、市場銷售抗菌藥(立服能、暢樂、桿菌速寧、髙益霉素、呼感毒菌清)、標(biāo)準(zhǔn)藥敏片(甲氧芐啶、氧氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、青霉素、諾氟沙星、氯霉素)、伊紅美藍(lán)瓊脂、

2 方法

2.1 流行病學(xué)調(diào)查

詳細(xì)詢問疫病的發(fā)病時間、發(fā)病率和死亡率，雞群免疫情況和發(fā)病后的治療情況，觀察臨床癥狀和病理變化。

2.2 病料的采取

病料:采自甘肅河西部分地區(qū)具有典型肝周炎、心包炎、氣囊炎的發(fā)病雞。無菌操作，在患有典型大腸桿菌病的禽類肝臟中采取(最好用無菌鑷子挑取肝臟內(nèi)的部分，以防污染)。

2.3 鏡檢

2.3.1 涂片 在肉湯中長出細(xì)菌后，用菌液涂片法涂片，用滅菌接種環(huán)蘸取菌液1～2接種環(huán)，均勻涂抹在載玻片上，使成直徑為1.5 cm左右圓形或橢圓形涂抹自然干燥。

2.3.2 染色 滴加適量的(足夠覆蓋抹出點即可)美蘭染色液，經(jīng)1～2 min,水洗，瀝去多余的水分，吸干(烘干，不能太熱)，然后鏡檢。

2.4 細(xì)菌的增殖培養(yǎng)

將采取的病料無菌操作接入肉湯培養(yǎng)基中，封緊試管口，放入揺床中，保持37℃的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后取出，觀察，放置在4℃的冰箱中保存。每只患病禽的病料接一個試管，并編號。

2.5 細(xì)菌的純化培養(yǎng)

采用劃線接種法，在無菌臺上，將已培養(yǎng)好的細(xì)菌劃線接種在伊紅美蘭瓊脂平板上，并放入37℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)16～24 h。

2.6 單個菌落的挑取

在無菌臺上，挑取伊紅美蘭瓊脂平板上生長的具有黑色帶金屬光澤的單個菌落，接種于肉湯培養(yǎng)基中，并在37℃的搖床中培養(yǎng)。

2.7 細(xì)菌的生化試驗

在無菌臺上，分別釣取十種菌的純培養(yǎng)物(滅一種菌接一試管生化試劑)，接種于半固體糖培養(yǎng)基(三糖鐵)中培養(yǎng)，觀察固體培養(yǎng)基的顏色變化及產(chǎn)生氣體情況；液體培養(yǎng)基做糖類、MR、VP、吲哚試驗；做好標(biāo)記后，放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)，在一周之內(nèi)觀察結(jié)果。切記：釣菌環(huán)在釣取每一種菌液后要滅菌，以防交叉感染。接種時先涂布斜面后穿布斜面，后穿刺底層置24℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,取出后觀察反應(yīng)情況，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行細(xì)菌種屬判定。

2.8 藥敏試驗

本試驗采用的是紙片擴(kuò)散法：用滅菌棉拭子分別蘸取鑒定過的并且已確定的大腸桿菌菌液，在管壁將多余的菌液擠去后，在瓊脂平板表面涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)60度，最后在平板內(nèi)緣涂抹一周，務(wù)必使菌液能均勻，經(jīng)室溫3～5 min后，用無菌小鑷子將上述藥敏試紙貼于平板表面(每換一張紙片都要滅菌一次鑷子)，并輕壓緊貼在平板表面，藥敏試紙一旦接觸平板就不要在移動，然后置于37℃培養(yǎng)過夜(16 h左右)后取出觀察結(jié)果。一般直徑90.0 mm的平皿可貼6張藥敏紙片，各紙片中心距離相距應(yīng)大于24 mm，紙片距離平板內(nèi)緣應(yīng)大于15 mm。

判定標(biāo)準(zhǔn)：按抑菌圈直徑大小作為敏感性高低的標(biāo)準(zhǔn)。抑菌圈直徑越大表明細(xì)菌對該藥的敏感性越高。抑菌圈直徑 15.1～20 mm者為高敏度敏感；直徑10.1～15 mm者為中度敏感；直徑在10 mm以下者為低度敏感。

3 試驗結(jié)果及分析

3.1 調(diào)查情況

養(yǎng)殖戶大都來自甘肅河西地區(qū)，普通肉雞和蛋雞較多，很少發(fā)現(xiàn)有其它品種雞，大致都在15～30日齡左右；據(jù)了解，養(yǎng)殖戶在日常情況下飼喂小雞時會拌點抗生素來防治病的發(fā)生，或者普通一些病再不了解的情況下也會用抗生素，若經(jīng)常使用抗生素，這無疑造成對某些抗生素產(chǎn)生耐藥性。

3.2 細(xì)菌的形態(tài)特征

培養(yǎng)物涂片后，美蘭染色后鏡檢，為粗短兩端鈍圓的小桿菌，多單個散在存在，個別成雙排列，無芽胞。

3.3 培養(yǎng)結(jié)果

已選擇的具有代表性的20株菌液，經(jīng) 37℃培養(yǎng)24～48 h，20株均能在普通營養(yǎng)肉湯中呈均勻混濁，管底有絮狀沉淀，液面有菌環(huán)；在普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成圓形隆起、光滑濕潤、中等大小灰白色菌落，直徑為1.5～2.0 um的圓形菌落。

但發(fā)現(xiàn)10株在伊紅美蘭瓊脂平板上培養(yǎng)，菌落呈黑色或黑紅色帶有金屬光澤的圓形菌落。

3.4 生化試驗

從10個伊紅美蘭瓊脂平板上生長的呈黑色或黑紅色帶有金屬光澤的圓形菌落，各挑取1個菌落進(jìn)行增殖培養(yǎng)后，進(jìn)行生化試驗。

通過臨床癥狀、病理變化、培養(yǎng)特性、分離鑒定、生化鑒定，最后確定8株為大腸桿菌。

3.5 藥敏試驗結(jié)果及分析

選擇已確定的8株大腸桿菌和一株不確定的菌液(1號)進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果(見表1)。

由表1可知，2、3、4號菌液對甲氧芐啶、氧氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、青霉素、諾氟沙星都已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性，但6、7、8號菌液對氧氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、青霉素、諾氟沙星都存在較高的敏感性(抑菌圈直徑在10～15 mm之間)，建議該養(yǎng)殖戶選取卡那霉素或者和慶大霉素、氧氟沙星、青霉素聯(lián)合使用來治療大腸桿菌病將會達(dá)到很好的效果。但是對甲氧芐啶和氯霉素已經(jīng)產(chǎn)生了很高的耐藥性，故最好不要選用此類藥物

表1 藥敏試驗結(jié)果 mm

4 結(jié)論

大腸桿菌病，春季是高發(fā)期，并且發(fā)病雞大致都在15～30日齡左右，大部分都出現(xiàn)了典型的臨床癥狀：包心、包肝。正常情況下，大腸桿菌對多種抗生素如卡那霉素、氯霉素、甲氧芐啶等磺胺類和呋喃類藥物都敏感，然而在本試驗甘肅省河西地區(qū)有些養(yǎng)殖場存在的大腸桿菌對甲氧芐啶、氧氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、青霉素、諾氟沙星都產(chǎn)生了很高的耐藥性，但有些養(yǎng)殖場對慶大霉素和氧氟沙星較敏感，且敏感率達(dá)50%以上。本實驗對有效防治大腸桿菌病有一定的參考價值，因此在臨床用藥時或在飼料中添加藥物時要注意，不要長期大量使用這幾種藥物。