腹腔鏡技術(shù)與傳統(tǒng)手術(shù)方法在綿羊胚胎移植中的應(yīng)用對比

葛守宏，王 斌，張知俠，劉炳琪,*

(1.靖邊縣草業(yè)綜合服務(wù)中心、靖邊縣北方牧業(yè)開發(fā)公司，陜西 靖邊 718500；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院)

胚胎移植又稱受精卵移植或借腹懷胎，是指通過一系列技術(shù)手段將優(yōu)良母畜的早期胚胎，或者通過體外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其他母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術(shù)。提供胚胎的個體稱為供體，接受胚胎的個體稱為受體，包含同期發(fā)情和超數(shù)排卵兩個關(guān)鍵技術(shù)。自1890年英國劍橋大學(xué)Walter Heape首次獲得兔受精卵移植成功至今，胚胎移植已發(fā)展成為一項比較成熟的動物輔助生殖技術(shù)。

腹腔鏡的組成主要包括硬質(zhì)套管窺鏡、冷光源、攝像系統(tǒng)、氣腹機(jī)和高頻發(fā)生器、沖洗/吸引設(shè)備六部分，目前獸用腹腔鏡主要包含硬質(zhì)套管窺鏡、冷光源、氣腹機(jī)三個部分。腹腔鏡手術(shù)，是指利用腹腔鏡及其相關(guān)器械進(jìn)行的手術(shù),使用冷光源提供照明，將腹腔鏡鏡頭插入腹腔，根據(jù)需要清晰觀察定位腹腔內(nèi)特定各組織和器官，并利用特制器械在腹腔內(nèi)或者將組織器官夾至體外完成手術(shù)目標(biāo)的過程。國內(nèi)腹腔鏡技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用起步較晚，國內(nèi)動物腹腔鏡技術(shù)主要應(yīng)用生殖系統(tǒng)，卵巢、卵泡、黃體及胚胎發(fā)育情況觀察，或在人工受精、胚胎移植過程中簡單地使用而已。

綿羊胚胎移植手術(shù)成功率受氣候、藥物、處理程序、個體差異、術(shù)后感染等諸多因素影響，手術(shù)操作方法可能也能對試驗結(jié)果造成一定影響。本試驗將傳統(tǒng)手術(shù)方法與腹腔鏡手術(shù)方法兩者進(jìn)行對比，將對腹腔鏡技術(shù)在綿羊胚胎移植中的應(yīng)用效果進(jìn)行一較為全面的評價，以期為臨床生產(chǎn)提供一定指導(dǎo)。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 供體羊為20頭經(jīng)產(chǎn)健康體格相近黑頭薩?？司d羊，10頭一組隨機(jī)分為兩組；受體羊為200頭經(jīng)產(chǎn)健康小尾寒羊，隨機(jī)分為兩組，各100頭；種公羊為25頭成年健康黑頭薩?？搜?，由當(dāng)?shù)胤N羊場提供。

1.1.2 試驗主要儀器設(shè)備 腹腔鏡及其配套設(shè)備(Austvet，澳大利亞生產(chǎn))、體視顯微鏡(OLYMPUS，型號SZX7)、常規(guī)外科器械、水浴鍋、恒溫箱、加熱板、進(jìn)口套管針、獸用B超(鄭州博祥來，型號BXL-V30)等。

1.1.3 試驗所用藥品 獸用亞硒酸鈉維生素E注射液為天津保靈動物保健品有限公司生產(chǎn)，羊用孕激素陰道緩釋裝置(CIDR)產(chǎn)自澳大利亞Zoetis有限公司，氯前列醇鈉(PG，0.2 mg×10支)、垂體促卵泡素(FSH，100 IU×10支)、促黃體素釋放素A3(LHRH-A3，25 μg×10支)均購自寧波第二激素廠，進(jìn)口FSH為加拿大生產(chǎn)FOLLTROPIN-V，沖胚液和胚胎保存液產(chǎn)自美國ICP公司，速眠新購自吉林康達(dá)動物藥業(yè)有限公司、鹿醒寧購自吉林華牧動物保健品有限公司，酒精、碘酒、新潔爾滅、生理鹽水、青霉素、鏈霉素等用品由獸醫(yī)室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗前期準(zhǔn)備 將胚胎移植所選供體、受體羊分別進(jìn)行隨機(jī)分組、標(biāo)記，于試驗前一周為每頭羊頸部肌肉注射5 mL亞硒酸鈉維生素E。按照腹腔鏡胚胎移植操作和傳統(tǒng)胚胎移植操作兩種不同操作方法分別標(biāo)記為A組(腹腔鏡組)、B組(傳統(tǒng)手術(shù)組)，兩組所用藥品和處理程序均一致，前期處理和手術(shù)操作B組均比A組推遲1 d進(jìn)行。

1.2.2 供體羊的預(yù)處理 對供體羊臀部肌肉注射1 mL PG，約36 h后種公羊試情，觀察記錄供體的發(fā)情狀況。

1.2.3 同期發(fā)情和超數(shù)排卵 同期發(fā)情過程應(yīng)用CIDR、FSH、PG完成，CIDR栓在羊陰道內(nèi)放置11 d，于撤栓前1 d早晚各注射一次FSH，次日撤栓同時注射PG；供體超數(shù)排卵主要應(yīng)用進(jìn)口FOLLTROPIN-V，采用連續(xù)遞減注射法進(jìn)行處理。處理完成后對受體羊早晚各試情一次并標(biāo)記隔離發(fā)情個體，供體羊撤栓后進(jìn)行試情和配種工作，于第一次發(fā)情后約12 h開始配種工作，第一次配種后肌肉注射1 mL LHRH-A3。

1.2.4 術(shù)前準(zhǔn)備 術(shù)前供體、受體羊術(shù)部剃毛，試驗羊群于手術(shù)前禁飼24 h，同時進(jìn)行手術(shù)場地的清潔消毒，手術(shù)物品高壓滅菌。

1.2.5 供體沖胚 在供體第一次配種后第6 d進(jìn)行，采用子宮角沖胚法，術(shù)前麻醉剃毛后，將供體保定于手術(shù)架，麻醉后于乳房前緣腹中線處按常規(guī)手術(shù)方法打開腹腔，將子宮體和卵巢牽拉至體外進(jìn)行子宮角沖胚，而后子宮體生理鹽水沖洗后還納至腹腔，縫合創(chuàng)口術(shù)部消毒后注射鹿醒寧。兩組供體羊沖胚方法和手術(shù)人員均相同。

1.2.6 檢胚 將沖卵液回收之后，盡快置于體視顯微鏡下，觀察記錄收集到的胚胎數(shù)量、形態(tài)及質(zhì)量，洗滌后將有效胚胎收集分裝備用。

1.2.7 受體胚胎移植

(1) 腹腔鏡移植方法。用手術(shù)刀或腹腔鏡打孔器在距離左右兩側(cè)乳房前緣約5 cm，距離腹正中線約3 cm處左右兩側(cè)各縱向切開一長度約1 cm的切口，穿透腹膜即可；從左側(cè)切口插入腹腔鏡目鏡，右側(cè)切口插入腹腔鏡，借助腹腔鏡和子宮鉗的移動配合，在受體體內(nèi)觀察子宮、卵巢形態(tài)，將黃體狀態(tài)良好、適宜移植的一側(cè)的子宮角用子宮鉗夾至腹腔外，而后迅速在子宮角注入胚胎。移植結(jié)束，用子宮鉗將子宮角還納入腹腔，左右切口各做一針結(jié)節(jié)縫合，穿透皮膚、肌肉、腹膜即可；術(shù)后注射鹿醒寧，術(shù)部噴灑碘酊消毒，術(shù)后注射3～5 d抗生素。

(2) 傳統(tǒng)手術(shù)法胚胎移植。術(shù)前準(zhǔn)備后，按常規(guī)手術(shù)方法沿乳房前緣腹中線處做一切口打開腹腔，將子宮體和卵巢牽拉至體外，選擇黃體狀態(tài)良好一側(cè)的子宮角移植胚胎，而后還納子宮至腹腔縫合創(chuàng)口，手術(shù)完成后注射鹿醒寧，術(shù)部消毒，術(shù)后注射3～5 d抗生素。

1.2.8 受體羊術(shù)后妊娠診斷 受體羊移植胚胎后，一般采取用種公羊?qū)κ荏w羊試情的方法，連續(xù)2個情期不返情的受體羊，即可判定受體羊發(fā)生妊娠反應(yīng)。本次試驗采用試情結(jié)合獸用B超儀對受體羊進(jìn)行妊娠診斷。

2 試驗結(jié)果

2.1 同期發(fā)情結(jié)果

同期發(fā)情處理結(jié)束后，利用種公羊?qū)┦荏w進(jìn)行試情，記錄發(fā)情結(jié)果如下。

表1 同期發(fā)情結(jié)果統(tǒng)計

2.2 供體超數(shù)排卵結(jié)果

于手術(shù)當(dāng) d進(jìn)行供體手術(shù)沖胚，未受精、發(fā)育不良均判定為無效胚胎，兩組試驗供體檢胚獲得以下結(jié)果：

表2 A組供體超排結(jié)果

表3 B組供體超排結(jié)果

2.3 受體移植結(jié)果

A組受體為腹腔鏡移植組，B組為傳統(tǒng)手術(shù)方法移植組，移植后至產(chǎn)羔完全結(jié)束收集兩組受體羊創(chuàng)口大小、術(shù)后感染、手術(shù)用時、受胎率、產(chǎn)羔率等數(shù)據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果記錄如下：

表4 兩組受體胚胎移植結(jié)果

3 分析與討論

本次試驗過程中，兩組供受體均相同人員使用相同操作方法進(jìn)行試驗，最大程度避免人為誤差。由試驗結(jié)果可知，腹腔鏡組受體移植受胎率(68.9%)高于傳統(tǒng)手術(shù)方法(61.9%)，同時使用腹腔鏡技術(shù)具有快速、創(chuàng)口小、出血少、應(yīng)激反應(yīng)小、手術(shù)感染風(fēng)險低等優(yōu)勢。在綿羊胚胎移植過程中，除自然因素外，人為操作也可對其結(jié)果產(chǎn)生較大影響，而腹腔鏡操作主要借助醫(yī)學(xué)儀器為工具，只要操作者經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)熟練掌握該技術(shù)，在一定程度上可降低人為因素對結(jié)果造成影響；由于可以通過目鏡直接在體內(nèi)觀察黃體狀態(tài)，可在最短時間內(nèi)將移植側(cè)子宮角夾至體外進(jìn)行胚胎移植，減少胚胎在體外生存時間降低胚胎死亡和污染風(fēng)險；另外，由于創(chuàng)口小出血少的特點，可有效降低受體移植后子宮黏連發(fā)病率，能夠提高受體羊的重復(fù)使用率和使用年限。但是腹腔鏡技術(shù)在綿羊胚胎移植手術(shù)中使用也有其限制，與子宮角胚胎移植相比，輸卵管移植手術(shù)中使用腹腔鏡技術(shù)操作難度較大，筆者將在以后探究腹腔鏡手術(shù)在輸卵管移植中的操作方法和應(yīng)用效果。

胚胎移植是加快優(yōu)良種畜繁殖和改良速度的有效手段，在綿羊的繁殖過程中具有重要地位，而隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腹腔鏡技術(shù)在綿羊胚胎移植技術(shù)中的應(yīng)用將更為普遍。本試驗通過將腹腔鏡和傳統(tǒng)手術(shù)方法在規(guī)?；驁雠咛ヒ浦仓羞M(jìn)行比較，對于腹腔鏡技術(shù)的應(yīng)用具有重要參考意義。