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    蛋白鮮味肽復(fù)合調(diào)味品生產(chǎn)技術(shù)研究

    2018-12-20 09:10:54鄒曉霜李佳妮齊寶坤王中江江連洲
    中國食物與營養(yǎng) 2018年11期

    王 虹,劉 鑫,鄒曉霜,李佳妮,王 歡,齊寶坤,王中江,江連洲

    (1黑龍江珍選食品有限公司,哈爾濱 150060;2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,哈爾濱 150030)

    風味肽具有加工性良好、易被消化吸收,并兼具有某些特定生理活性等諸多優(yōu)點,其中鮮味肽在保有其他味覺條件不被破壞的情況下,還可提升各自的呈味風味,所以鮮味肽在菜、乳、肉等食材增味方面具有突出效果[1-3]。目前,我國研制的復(fù)合調(diào)料存在食用品質(zhì)差、風味失真等缺陷[4]。本試驗利用定向分段酶解技術(shù)酶解鮮味原料底物,即沙丁魚及對蝦[5],經(jīng)前階段試驗已探究出復(fù)合蛋白酶初步酶解最優(yōu)工藝,即復(fù)合蛋白酶加酶量3.3%、溫度57℃、酶解時間3.5h、pH7.1,將蛋白較充分地水解成肽片段,結(jié)構(gòu)更為松散后,再加入風味復(fù)合酶實現(xiàn)第二階段的酶解[6],如此可在保證傳統(tǒng)鮮味的同時,提高蛋白質(zhì)得率,便于人體吸收。采用單因素試驗及響應(yīng)面法,以優(yōu)化風味蛋白酶添加量、酶解時間、溫度及pH等工藝,最終確定定向分段酶解條件,并以對蝦及沙丁魚水解液為原料與其他調(diào)味原料復(fù)配,開發(fā)新型海鮮調(diào)味料[7],為研發(fā)新型高鮮、高香以及高營養(yǎng)特性的海鮮復(fù)合調(diào)味品開辟新途徑。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1材料 對蝦、沙丁魚,市售;復(fù)合蛋白酶,諾維信(中國)投資有限公司;濃硫酸、硼酸 、TCA、NaOH、CuSO4·5H2O、K2SO4、甲基紅、溴甲酚綠,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;酶解液、葡萄糖、白砂糖、食鹽、醬油、海藻酸鈉、淀粉、生姜粉,均為食品級。

    1.1.2儀器與設(shè)備 Mettler Toledo分析天平,上海衡平有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋,上海一恒有限公司;F-4500型熒光分光光度計,日本Hitachi公司;GL-25MS 超速高速冷凍離心機,上海盛析儀器設(shè)備有限公司;超濾裝置,無錫賽普膜科技發(fā)展有限公司;KND2C型定氮儀,上海纖撿儀器有限公司;數(shù)顯臺式酸度計,上海浦春計量儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥儀,上海亞榮有限公司;PF6原子熒光儀、TSA-986 原子吸收儀,北京普析有限公司;FDU-1200冷凍干燥機,日本東京Rikakikai公司;L-8900氨基酸分析儀,日本日立高科技有限公司;Mersham蛋白質(zhì)純化系統(tǒng),美國曼德公司;Superdex peptide 10/300 GL分析柱,美國上海諾磁公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1酶解提肽方法 前期階段添加復(fù)合蛋白酶酶解[8],將蛋白顆粒先被水解為肽片段,酶解條件:復(fù)合蛋白酶加酶量3.3%、溫度57℃、酶解時間3.5h、pH7.1。結(jié)構(gòu)松散后,離心得上清液,再加入風味復(fù)合酶實現(xiàn)第二階段的酶解,去除苦味肽,離心后取上清液即為酶解成品。分段酶解技術(shù)不僅提高多肽得率,同時增加氨基酸含量,使鮮味更加濃郁。

    1.2.2酶解工藝流程[9-10]原料→解凍→粉碎→蝦魚漿→混合液→復(fù)合蛋白酶水解→滅酶→離心→過濾→取上清液→風味蛋白酶水解→滅酶→離心→過濾→取上清液→成品

    1.2.3基本指標測定 總氮量依據(jù)GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》方法測定[11],氨基態(tài)氮含量根據(jù)ZBX 66038—1987《基態(tài)氮測定法》方法進行測定[12]。水解度的測定如式(1)所示,用以表征底物蛋白中被水解肽鍵數(shù)占肽鍵總數(shù)的百分含量[13]。

    (1)

    1.2.4響應(yīng)面試驗設(shè)計 針對采用風味酶對鮮味肽進行二次酶解試驗中,以各酶解工藝參數(shù)酶解溫度x1(℃)、酶解pH x2、酶解時間x3(h)、酶添加量x4(%)作自變量,鮮味肽水解率作響應(yīng)值(表1)。

    表1 因素水平編碼

    1.2.5酶解液多肽分子量分布 取離心后酶解液上清液,通過Amersham 蛋白純化系統(tǒng),Superdex peptide 10/300 GL分析柱,在洗脫液0.25 mol/L氯化鈉、0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液、pH 7.2、進樣體積50 μL、檢測波長214 nm、流速0.5 mL/min條件下[14],進行酶解液多肽分子量分布測定。

    1.2.6酶解液氨基酸分析[15]將定量樣品移至水解管內(nèi),添加6 mol/L HCl,抽真空后并封管。于水解器中在110°C條件下水解24h。定容后進行過濾操作,對所得濾液加以干燥使其成固態(tài),隨后試樣溶解于0.02 mol/L HCl并調(diào)整至適合的濃度,使用氨基酸分析儀進行氨基酸類型及組成成分測定[16-17]。

    1.2.7酶解液美拉德反應(yīng) 取分子量不同的酶解組分樣品1.5 g,依次添加1.5 g葡萄糖、0.3 g食用姜粉、0.3 g NaCl、蒸餾水10 mL,加溫至115°C后加熱0.5h以開始美拉德反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束停止后即刻冷卻樣品至室溫。隨后用蒸餾水將反應(yīng)溶液稀釋到適宜濃度,留待感官評價[18]。

    1.2.8調(diào)味料配方[19]以酶解濃縮液為基料,添加白砂糖、食鹽、味精、淀粉(食品級)等輔料制備混合調(diào)味料。

    1.2.9數(shù)據(jù)分析 每組試驗重復(fù)3次,試驗數(shù)據(jù)使用SigmaPlot 12.5軟件繪制趨勢曲線圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 風味蛋白酶酶解條件確定

    通過單因素試驗對風味蛋白酶的時間、酶添加量、pH及酶解溫度等工藝條件進行優(yōu)化,以確定風味蛋白酶酶解的最適工藝參數(shù)。

    2.1.1風味蛋白酶酶解單因素試驗

    (1)加酶量對酶解效果的影響:由圖1可知,pH調(diào)整至7、酶解時間1 h、酶解溫度50°C時,水解度的變化趨勢為先升高后降低。加酶量為1%時水解度最高。(2)酶解時間對酶解效果的影響:由圖2可知,pH調(diào)整至7、酶添加量1%、酶解溫度50℃時,水解度的變化趨勢為先上升后下降。時間為2 h時水解度最高。(3)pH對酶解效果的影響:由圖3可知,在酶解溫度50℃、酶解時間1h、酶添加量1%,水解度的變化趨勢為先上升后下降。pH為7時水解度最高。(4)溫度對酶解效果影響:由圖4可知,調(diào)整pH至7、酶解時間1 h、酶添加量1%,水解度的變化趨勢呈先上升后下降。其中,酶解溫度50°C時蛋白水解程度最大。

    圖1 加酶量對酶解效果的影響

    圖2 酶解時間對酶解效果的影響

    圖3 pH對酶解效果的影響

    圖4 溫度對酶解效果影響

    2.1.2風味蛋白酶酶解響應(yīng)面試驗結(jié)果

    (1)風味蛋白酶酶解鮮味肽響應(yīng)面試驗:以單因素試驗為基礎(chǔ),依照Box-Behnken響應(yīng)面法的試驗要求,開展多組試驗(表2)。采用Design Expert軟件分析,將溫度、pH、酶解時間及酶添加量作響應(yīng)變量,以水解率作響應(yīng)值進行回歸分析,得到預(yù)測模型如式(2):

    Y=63.51+1.85X1+2.46X2-2.76X3-3.68X4+4.98X1X2+0.50X1X3-0.22X1X4+1.92X2X3+2.81X2X4-3.08X3X4-5.39 X12-5.75X22-2.54X32-5.27X42

    (2)

    表2 響應(yīng)方案及結(jié)果

    表3 回歸與方差分析結(jié)果

    (2)因素間的交互作用:根據(jù)表3可得,交互項x1×x2對鮮味肽水解率影響極顯著,重點分析交互項AB對水解度(Y)的影響,固定模型中的酶解時間x3=2h和加酶量x4=1%,x1×x2交互作用的三維曲面圖與等高線圖見圖5。

    圖5 交互項x1×x2對水解度的影響

    2.2 酶解液成分的測定

    2.2.1酶解液中多肽分子量分布的測定結(jié)果 由圖6~7可見,一次酶解液中多肽主要集中在3 000~5 000 Da以上,占到44.15%,大于10 000 Da肽段的比例最低,為4.67%。相比一次酶解液,二次酶解液中分子量大于5 000Da的肽段比例顯著降低,1 000~3 000 Da肽段比例最大,可見,通過二次酶解能較好地降解大分子量的片斷。酶解液通過二次酶解后,產(chǎn)物中分子量小于5 000 Da 的肽段比例顯著提高,酶解產(chǎn)物中肽段分子量主要分布在1 000~3 000 Da及3 000~5 000 Da這兩部分,占總肽段的比例為88.2%。

    綜上所述,通過復(fù)合酶水解能較好地降解海鮮中分子量大于10 000 Da的片斷,酶解產(chǎn)物中分子量主要分布在3 000~5 000 Da,而經(jīng)過風味蛋白酶進行二次酶解后,其中分子量大多分布于1 000~3 000 Da內(nèi)。目前研究人員分離得到的鮮味肽也主要是分子量介于3 000Da以下的寡肽,可見,兩次酶解液的肽分子量分布特點證明,二次酶解有助于酶解更加充分,使大分子量的肽分解成寡肽的轉(zhuǎn)化率更高,更有助于鮮味的體現(xiàn)。

    圖6 一次酶解液的肽分子量分布

    圖7 二次酶解液的肽分子量分布

    2.2.2最佳條件下酶水解液中氨基酸的含量測定

    (1)復(fù)合蛋白酶水解液中氨基酸的含量:以復(fù)合蛋白酶酶解后樣品中氨基酸量為參照,以其中氨基酸含量對后續(xù)試驗中風味酶解對氨基酸的影響進行比對考察(表4)。(2)復(fù)合蛋白酶與風味蛋白酶分段酶解液中氨基酸含量:比對表4,參照表5可知,雙酶水解后的水解液中,各種氨基酸的含量均有較顯著提升。大量氨基酸是進行美拉德反應(yīng)的先決條件,可見雙酶解試驗后不但能改善產(chǎn)品風味,還能大量提取初次水解液中的氨基酸,試驗效果十分顯著。

    表4 復(fù)合蛋白酶解液中各種氨基酸的含量

    表5 分段酶解液中各種氨基酸的含量

    2.2.3美拉德驗證風味試驗 通過初次水解液及風味酶二次水解液的美拉德反應(yīng),判斷對比其最終風味。從表7可以看出,單一酶水解得到的水解液經(jīng)美拉德反應(yīng)后烤魚味一般,呈現(xiàn)苦腥味;而經(jīng)復(fù)合及風味蛋白酶二次水解后的水解液感官上均好過僅經(jīng)單一酶水解的樣品,故經(jīng)復(fù)合蛋白酶及風味蛋白酶二次水解是必要的。

    表6 美拉德反應(yīng)感官評定

    2.2.4調(diào)味料的制備 以酶解液為基料,按照以下配方進行調(diào)配:酶解液100 mL、白糖8 g、食鹽4 g、醬油14 mL、淀粉7.5 g、海藻酸鈉0.05 g、姜汁3 mL、香油2 mL,加熱濃縮至一定稠度后即可制備出具有海鮮風味的復(fù)合調(diào)味料。該產(chǎn)品呈半流體狀、味道鮮美、口感天然,具有海產(chǎn)品特有香氣,其產(chǎn)品質(zhì)量指標見表7。

    表7 復(fù)合調(diào)味料質(zhì)量指標

    3 結(jié)論

    試驗選擇對蝦及沙丁魚作原材料,利用復(fù)合蛋白酶及風味蛋白酶雙酶定向分段酶解手段生產(chǎn)高附加值鮮味提升肽,充分實現(xiàn)了對水產(chǎn)資源的高效利用。在采用復(fù)合蛋白酶初步水解基礎(chǔ)上,確定風味蛋白酶二次酶解生產(chǎn)鮮味肽的最佳工藝參數(shù):溫度51℃、pH 7.1、酶解時間1.9h、酶添加量1.0%,該條件下實現(xiàn)的雙酶解工藝使得水解率高達64.24%。相較于初次酶解,風味酶的二次水解能夠顯著提升酶解液內(nèi)氨基酸含量,且二次水解液經(jīng)美拉德反應(yīng)后質(zhì)量也明顯優(yōu)于初次水解液。以二次水解液為基料開發(fā)海鮮調(diào)味料,產(chǎn)品風味宜人,工藝簡便且不需添加味精或其他鮮味劑,口味自然,具有較樂觀的開發(fā)前景及市場預(yù)期?!?/p>

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