哲羅鮭（Hucho taimen）卵巢發(fā)育過程中下丘腦-垂體-性腺軸（HPG軸）相關(guān)因子的動(dòng)態(tài)變化

任廣明，佟廣香，張永泉，徐黎明，盧彤巖，尹家勝

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

魚類的生殖過程是在下丘腦、腦垂體、性腺組成（稱下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamus-pituitary-gonadal axis，HPG軸）的神經(jīng)與內(nèi)分泌系統(tǒng)整體控制下進(jìn)行[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)接受外界環(huán)境因子（如食物、光周期、溫度、鹽度、性信息素等）的刺激后，激發(fā)神經(jīng)分泌細(xì)胞釋放小分子神經(jīng)介質(zhì)傳遞給下丘腦，使下丘腦分泌合成促性腺激素釋放激素（GnRH），促使垂體分泌促性腺激素（GtHs），即促濾泡激素（FSH）和促黃體激素（LH）[2-4]。FSH與LH在不同階段刺激性腺產(chǎn)生多種性類固醇激素（雄激素、雌激素和孕激素等），具有調(diào)控配子最終成熟、促使卵母細(xì)胞或精子最后成熟、刺激排放的作用[1]。性類固醇激素除了調(diào)節(jié)卵黃和精子的發(fā)生，還能在下丘腦和垂體水平上通過正反饋刺激性未成熟魚類GnRH和GtHs的合成與釋放，啟動(dòng)HPG軸的功能，刺激性腺發(fā)育。可見，魚類的性腺發(fā)育依賴于HPG軸有節(jié)奏地相互協(xié)調(diào)與制約，是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控下多種激素共同作用的生理過程。

哲羅鮭Hucho taimen是鮭形目鮭科哲羅魚屬的一種大型珍稀冷水性經(jīng)濟(jì)魚類。隨著全人工繁育和苗種馴化關(guān)鍵技術(shù)的突破，哲羅鮭養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展[5]。近年來，有關(guān)哲羅鮭稚魚的生長、營養(yǎng)需求、胚胎與仔魚發(fā)育、肌肉營養(yǎng)價(jià)值[6-9]等方面取得了一定進(jìn)展，但對(duì)哲羅鮭生殖調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍很匱乏。隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，如親魚卵巢發(fā)育不良、產(chǎn)卵效率和孵化率下降等問題凸顯，嚴(yán)重制約哲羅鮭苗種生產(chǎn)，阻礙養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展。神經(jīng)內(nèi)分泌激素協(xié)同、穩(wěn)定地調(diào)控是促使雌親魚性腺發(fā)育成熟與產(chǎn)卵的關(guān)鍵。因此，為了深入了解HPG軸對(duì)哲羅鮭卵巢發(fā)育的調(diào)控作用，本試驗(yàn)測定卵巢處于不同發(fā)育期的7齡雌哲羅鮭血清中雌二醇（E2）與睪酮（T）的含量，檢測下丘腦GnRH、垂體FSH與LH及肝臟卵黃蛋白原（Vitellogenin，Vtg）mRNA表達(dá)水平的變化，同時(shí)分析生殖激素基因、性腺指數(shù)（GSI）和性類固醇激素的相關(guān)性關(guān)系，以期為揭示哲羅鮭生殖調(diào)控機(jī)制提供新的思路和基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用哲羅鮭親魚來自黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水魚試驗(yàn)站，挑選體質(zhì)健壯、規(guī)格和體質(zhì)量基本一致的同一批全人工培育的7齡雌哲羅鮭，全長70～80cm，體質(zhì)量 4 500～4 700g。

1.2 采樣

定期選取卵巢處于不同發(fā)育期的7齡雌性哲羅鮭，以MS-222麻醉（300mg/L）后尾部采血，血液4℃靜置后于2 000r/min離心30min，收集血清于-20℃保存，用于測定血清中E2與T含量。試驗(yàn)魚逐尾采血后，分別采集肝臟與性腺組織，將采集到的性腺組織快速稱重用于計(jì)算GSI[100%×性腺質(zhì)量/（體質(zhì)量-性腺質(zhì)量）]。打開試驗(yàn)魚頭顱，采集位于間腦后側(cè)丘腦下方的下丘腦及丘腦末端垂體窩內(nèi)垂體組織。將采集到的肝臟、性腺、下丘腦及垂體組織置于液氮中冷凍后貯存于-80℃低溫冰箱中備用。

1.3 血清中E2與T含量的測定

嚴(yán)格按照上海酶聯(lián)生物科技有限公司試劑盒的說明書，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清樣品中E2和T的含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清樣品中激素的含量，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。

1.4 基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

參照 Trizol Reagent（Invitrogen，USA）說明書的方法提取下丘腦、垂體與肝臟組織RNA。采用多功能酶標(biāo)儀檢測RNA的濃度與純度；利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。利用OneStepSYBRPrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit（TaKaRa，Japan）試劑盒測定基因表達(dá)水平變化。具體過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。根據(jù)GenBank上GnRH（大西洋鮭，Salmo salar）、LH（虹鱒，Oncorhynchus mykiss）、FSH（大西洋鮭，Salmo salar）、Vtg（大西洋鮭，Salmo salar）的基因序列，利用Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異引物，引物大小為100～150bp，引物序列見表1。以管家基因β-actin（亞東鮭，Salmo trutta fario）作為內(nèi)標(biāo)基因，用比較 CT 法（ΔΔCT）分析數(shù)據(jù)，取3次重復(fù)的平均值。

表1 哲羅鮭生殖激素基因熒光定量引物Tab.1 Primers for quantitative real-time PCR analysis of reproductive hormones in taimen

1.5 數(shù)據(jù)分析

GSI與性類固醇激素含量等數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，對(duì)GSI、血清性類固醇激素、相關(guān)激素mRNA表達(dá)水平分別進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。用SPSS19.0軟件對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵巢發(fā)育分期與GSI

以組織切片中觀察到的占優(yōu)勢的卵細(xì)胞的發(fā)育期作為性腺的發(fā)育分期[10]。據(jù)此將采集到的哲羅鮭卵巢發(fā)育過程分為：Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期早期、Ⅳ期中期、Ⅳ期晚期、Ⅴ期早期、Ⅴ期中期。哲羅鮭不同發(fā)育期的卵巢GSI指數(shù)變化見圖1。由圖1可知，不同時(shí)期內(nèi)卵巢GSI指數(shù)變化差異顯著（P＜0.05）。Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期中期卵巢的GSI相對(duì)較低（＜5），Ⅳ期末期和Ⅴ期早期卵巢GSI明顯上升至（7.91±1.64）%，至Ⅴ期中期卵巢時(shí)達(dá)（8.43±1.56）%。

圖1 哲羅鮭不同發(fā)育期卵巢的性腺指數(shù)Fig.1 Gonado-somatic index of ovary at different developmental stages in taimen

2.2 下丘腦GnRH mRNA在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

由圖2-A可知，哲羅鮭產(chǎn)卵后（Ⅱ期卵巢）下丘腦GnRH mRNA的表達(dá)水平仍較高，隨后（Ⅲ期）其表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；GnRH mRNA在卵巢發(fā)育至Ⅳ期時(shí)，其表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高（Ⅳ期早期）后降低趨勢（Ⅳ期中期、Ⅳ期晚期）（P＜0.05）；卵巢發(fā)育至Ⅴ期中時(shí)，GnRH mRNA表達(dá)水平急劇升高，顯著高于各階段（P＜0.05）。

2.3 垂體FSH與LH mRNA在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

Ⅱ期卵巢時(shí)，垂體FSH mRNA的表達(dá)量較低；隨著卵巢發(fā)育至Ⅲ期，F(xiàn)SH mRNA表達(dá)量達(dá)到較高水平，隨后顯著下降（P＜0.05）（圖2-B）。卵巢發(fā)育到Ⅳ期中期，F(xiàn)SH mRNA表達(dá)水平再一次緩慢升高，在Ⅴ期時(shí)達(dá)峰值，隨后顯著下降至Ⅳ早期表達(dá)水平。由圖2-C可知，在卵巢發(fā)育過程中垂體LH mRNA表達(dá)水平呈波動(dòng)變化趨勢，與FSH mRNA變化趨勢相似。產(chǎn)卵后LH mRNA的表達(dá)水平較低；Ⅲ期時(shí)，表達(dá)量達(dá)峰值，隨后顯著下降（P＜0.05）。Ⅳ期時(shí)垂體LH mRNA的表達(dá)水平較低。Ⅳ晚期時(shí)，LH mRNA表達(dá)水平再一次呈現(xiàn)顯著升高趨勢，至Ⅴ早期表達(dá)水平迅速下降。

2.4 肝臟Vtg mRNA在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

如圖2-D所示，Ⅱ期和Ⅲ期時(shí)，肝臟VtgmRNA表達(dá)量較低（P＜0.05）。Ⅳ期中期時(shí)，肝臟VtgmRNA表達(dá)量最高，隨著卵巢的不斷發(fā)育，Vtg mRNA的表達(dá)顯著下降至Ⅱ期和Ⅲ期卵巢水平（P＜0.05），不同發(fā)育時(shí)期差異顯著（P＜0.05）。

2.5 血清E2與T在卵巢不同發(fā)育期的含量變化

如圖3-A所示，卵巢在Ⅱ期和Ⅲ期時(shí)，哲羅鮭血清中E2含量維持在較高水平；隨著卵巢的發(fā)育，血清E2的含量顯著降低，Ⅳ期早期時(shí)降至（13.93±0.14）pmol/L（P＜0.05）；Ⅳ期中期、晚期時(shí)，血清 E2含量保持在15.21～15.43pmol/L，卵巢發(fā)育至Ⅴ期早期時(shí)血清E2含量有所下降，降至（14.38±0.14）pmol/L；進(jìn)入Ⅴ期中期時(shí)，血清E2含量逐漸升高至Ⅱ期和Ⅲ期卵巢時(shí)水平。卵巢在Ⅱ期和Ⅲ期時(shí)，血清T含量維持在60pg/mL左右（圖3-B），在Ⅳ期早期其含量顯著下降到（53.64±1.61）pg/mL，隨后T含量顯著升高，在Ⅳ期中期達(dá)到最高；進(jìn)入Ⅴ期血清T含量顯著下降；Ⅴ期中期血清T含量有所升高，但與Ⅳ期早期差異不顯著（P＞0.05）。

2.6 相關(guān)性分析

圖2 哲羅鮭下丘腦GnRH mRNA（A）、垂體FSH（B）與LH（C）mRNA和肝臟Vtg mRNA（D）在卵巢不同發(fā)育期的表達(dá)Fig.2 Expression of GnRH mRNA in hypothalamus（A）,pituitary FSH（B）and LH（C）mRNA and liver Vtg mRNA（D）of taimen during the ovarian development

圖3 卵巢處于不同發(fā)育期的哲羅鮭血清E2與T的含量變化Fig.3 Changes in serum E2（A）and T（B）levels of taimen during the ovarian development

表2 生殖相關(guān)因子與性腺指數(shù)相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between reproductive factors and GSI

哲羅鮭卵巢發(fā)育過程中，GSI與下丘腦GnRH mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而與血清T含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。血清T含量與肝臟Vtg mRNA表達(dá)水平存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。下丘腦GnRH mRNA表達(dá)水平與垂體FSH mRNA表達(dá)水平呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），而垂體FSH mRNA表達(dá)水平與LH mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

3 討論

HPG軸作為核心的神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)主導(dǎo)著魚類性腺發(fā)育過程中整個(gè)過程。在性腺發(fā)育及配子生成前期，感覺器官把外界的刺激通過神經(jīng)聯(lián)系傳遞到下丘腦，促使下丘腦分泌細(xì)胞的合成與分泌GnRH[1]。GnRH是HPG軸的關(guān)鍵神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子，其mRNA表達(dá)水平在性腺發(fā)育周期內(nèi)不斷地變化，與性腺發(fā)育呈正相關(guān)的規(guī)律。已有研究報(bào)道，GnRH mRNA表達(dá)水平在圓斑星鰈Verasper variegatus[11]、虹鱒 Oncorhynchus mykiss[12]、平鲉 Sebastes rastrelliger[13]等魚類卵巢發(fā)育周期內(nèi)存在顯著差異，在排卵和產(chǎn)卵期間表達(dá)水平最高，產(chǎn)卵后GnRH mRNA表達(dá)量顯著降低，這與本研究中GnRH mRNA表達(dá)水平的變化趨勢相似。垂體分泌的促性腺激素為FSH與LH[2-4]。FSH在魚類性腺發(fā)育早期階段主要刺激性腺分泌性類固醇激素，而LH則能促使卵母細(xì)胞最終達(dá)到成熟，是決定魚類產(chǎn)卵的關(guān)鍵調(diào)控因子[14]。在自然條件下，高表達(dá)的GnRH能夠刺激垂體合成與分泌大量的FSH與LH[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，雌哲羅鮭性腺發(fā)育Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期時(shí)FSH維持相對(duì)較高的表達(dá)水平，這有利于促進(jìn)性腺分泌E2和T等性類固醇激素。然而，在哲羅鮭排卵前高表達(dá)的GnRH并未促使腦垂體高表達(dá)FSH與LH，這可能是由于試驗(yàn)用魚是在全人工條件下飼養(yǎng)，雌哲羅鮭無法進(jìn)行生殖洄游，腦垂體發(fā)生功能異常等原因所致。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，垂體FSH與LH具有顯著的正相關(guān)關(guān)系，這說明它們協(xié)同調(diào)控卵巢發(fā)育，能明顯促進(jìn)卵巢的分化與成熟。

卵黃蛋白原（Vtg）是所有卵生脊椎動(dòng)物卵黃蛋白的前體，是雌魚類卵黃的主要成分。Vtg作為一種功能性物質(zhì)促進(jìn)卵母細(xì)胞的生長和分化，為卵細(xì)胞和胚胎提供發(fā)育所需的營養(yǎng)與能源物質(zhì)[16]。目前已廣泛研究了魚類性腺發(fā)育周期內(nèi)Vtg的變化。在沙塘鱧Odontobutis potamophila[17]、中華鱘 Acipenser sinensis[18]和鯰 Clarias batrachus[19]產(chǎn)卵前（Ⅴ期卵巢）肝臟/血清中Vtg的含量最高，以確保卵巢分化、胚胎和幼體發(fā)育的營養(yǎng)所需。本研究結(jié)果顯示，雌哲羅鮭在性腺發(fā)育早期，肝臟VtgmRNA表達(dá)相對(duì)較低，隨著卵巢發(fā)育至Ⅳ期中期時(shí)，Vtg mRNA表達(dá)水平則達(dá)到最高。全人工培育條件下，雌哲羅鮭卵巢發(fā)育到Ⅲ期時(shí)出現(xiàn)卵黃顆粒，Ⅳ期早期時(shí)逐漸增多，到Ⅳ期中-晚期卵黃顆粒體積增大并充滿卵母細(xì)胞[20]。結(jié)合本研究結(jié)果可以看出，哲羅鮭卵巢中卵黃物質(zhì)的積累與卵母細(xì)胞的發(fā)育呈現(xiàn)同步發(fā)展的關(guān)系。肝臟中VtgmRNA的表達(dá)，促使卵黃物質(zhì)迅速積累，保證營養(yǎng)物質(zhì)向性腺轉(zhuǎn)移與積累，決定卵細(xì)胞最終的發(fā)育與成熟?？梢?，了解雌哲羅鮭性腺發(fā)育周期內(nèi)肝臟VtgmRNA表達(dá)的變化規(guī)律將為親魚生殖階段營養(yǎng)供給提供重要的理論依據(jù)與參考。

E2與T由卵巢分泌，參與配子的發(fā)育、最終成熟和配子排放過程，是魚類性腺成熟的關(guān)鍵調(diào)控因子[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在斜帶石斑魚Epinephelus coioides[21]、西伯利亞鱘Acipenser baeri[22]、圓斑星鰈Verasper variegatus[23]的血漿中性類固醇激素（E2與T）含量在排卵前顯著升高，排卵后迅速下降。本研究中，雌哲羅鮭在Ⅱ期卵巢時(shí)血清E2與T含量相對(duì)較低，說明親魚正處于恢復(fù)生長和營養(yǎng)積累的階段。Ⅳ期卵巢是卵子卵黃發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期，大量合成Vtg，隨后T將Vtg運(yùn)輸?shù)铰鸭?xì)胞內(nèi)[1]，這說明E2與T參與了配子卵黃發(fā)生的調(diào)控過程[24,25]。本研究中，隨著哲羅鮭卵母細(xì)胞中卵黃發(fā)生基本完成，血清中E2與T含量降低，當(dāng)親魚卵巢發(fā)育至Ⅴ期時(shí)，血清中E2與T含量明顯增加，這在一定程度上說明E2與T在親魚產(chǎn)卵前起正向調(diào)節(jié)性腺發(fā)育的功能。

綜上所述，GnRH、FSH與LH以協(xié)同的方式共同參與了哲羅鮭卵巢發(fā)育的過程，其調(diào)控作用與Vtg、E2與T的合成與分泌緊密相關(guān)。了解哲羅鮭卵巢發(fā)育過程中性激素因子的變化規(guī)律，將有助于系統(tǒng)、科學(xué)地開展哲羅鮭人工繁育與健康養(yǎng)殖。然而，在全人工飼養(yǎng)條件下，哲羅鮭性腺發(fā)育受到了諸多因素的影響，HPG軸的調(diào)控機(jī)制還需結(jié)合環(huán)境因子、人為干預(yù)等因素進(jìn)行深入的探討與研究。