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    水稻斑點(diǎn)葉突變體Spl34的表型鑒定及理化指標(biāo)分析

    2018-12-20 03:26:22王茂輝鐘春燕羅文龍聶金泉陳志強(qiáng)
    中國(guó)種業(yè) 2018年12期
    關(guān)鍵詞:開(kāi)花期紫外光突變體

    王茂輝 鐘春燕 羅文龍 聶金泉 郭 濤 王 慧 陳志強(qiáng)

    (1廣東省肇慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,肇慶526000;2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,廣州510000;3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心,廣州510642)

    一般來(lái)說(shuō)斑點(diǎn)葉突變體是指植物在未遭受病原物侵染或明顯逆境條件下,在植株葉片上自發(fā)形成壞死斑的一類(lèi)葉色突變體[1]。水稻斑點(diǎn)葉突變體的鑒定主要是通過(guò)對(duì)變異表型的觀察,突變體的主要特征是葉片或葉鞘上出現(xiàn)不同顏色、大小和形狀的斑點(diǎn)。水稻葉片出現(xiàn)的斑點(diǎn)顏色大多為褐色,也有些突變?yōu)榧t褐色、暗褐色、橙黃色和白色[2]。斑點(diǎn)葉基因作用十分廣泛,涉及很多生理生化過(guò)程,一般包括生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和死亡等。已鑒定的水稻斑點(diǎn)葉突變體,大多數(shù)由細(xì)胞死亡引起斑點(diǎn)表型,而僅有spl30[3]是非細(xì)胞死亡型斑點(diǎn)葉突變體。由于類(lèi)病變表型與病原菌侵染后的超敏反應(yīng)癥狀類(lèi)似,因此斑點(diǎn)葉突變體成為了研究細(xì)胞程序性死亡(PCD,Programmed cell death)和防衛(wèi)反應(yīng)的理想材料[4]。由于活性氧(ROS,Reactive oxygen species)和活性氮(RNS,Reactive nitrogen species)是植物響應(yīng)生物和非生物脅迫的信號(hào)分子,能激活防御基因和誘導(dǎo)PCD,因此引起ROS和RNS失衡的基因突變都可能造成局部細(xì)胞死亡,這也是產(chǎn)生斑點(diǎn)葉變異常見(jiàn)的分子機(jī)制[5]。許多斑點(diǎn)葉突變體都伴隨抗病性提高及抗病反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)的組成性表達(dá),如胼胝質(zhì)的積累、防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的激活、水楊酸含量升高。

    突變體是功能基因組學(xué)研究的重要材料,近年來(lái),利用水稻突變體進(jìn)行水稻功能基因組學(xué)研究取得重大進(jìn)展[6-7]。發(fā)掘和鑒定各式各樣的水稻斑點(diǎn)葉突變體,不僅有助于葉綠素合成與降解途徑及光合作用機(jī)理的研究,還有助于水稻品種改良和抗病性研究。本研究前期獲得了一個(gè)自發(fā)突變的斑點(diǎn)葉突變體,進(jìn)而對(duì)突變體Spl34其他農(nóng)藝性狀進(jìn)行鑒定,包括田間表型、生理生化指標(biāo)、稻米品質(zhì)及對(duì)光合作用的影響等方面,為進(jìn)一步摸清突變體Spl34的生物學(xué)效應(yīng)和今后的育種利用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料 斑點(diǎn)葉突變體Spl34是從正常綠葉品種粵晶絲苗2號(hào)和H4的F2群體中獲得的自然突變體,連續(xù)多代種植后其突變表型穩(wěn)定遺傳。在前期研究的基礎(chǔ)上,以F8突變體Spl34單株分離的無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)為對(duì)照,對(duì)突變體Spl34進(jìn)行農(nóng)藝及品質(zhì)性狀、種子活力、生理生化指標(biāo)等研究。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 突變體Spl34田間表型及農(nóng)藝性狀 2016年早季,將突變體Spl34和無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)科研教學(xué)實(shí)驗(yàn)基地,分蘗期觀察田間條件下突變體Spl34和無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)的株高、葉片的生長(zhǎng)情況;成熟期比較植株、稻穗、籽粒的表型差異及葉斑發(fā)生情況,并對(duì)株高、單株穗重、一次枝梗數(shù)、穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率、粒長(zhǎng)、粒寬、千粒重等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查。

    1.2.2 種子活力及米質(zhì)分析 種子活力分析是從每個(gè)材料篩選后的種子中隨機(jī)取300粒,分成3組,分別放在鋪有濕紙的發(fā)芽盒中,置于恒溫箱保持適宜溫度30℃,一般3~4d計(jì)算發(fā)芽勢(shì)、6~7d計(jì)算發(fā)芽率。米質(zhì)分析是對(duì)突變體Spl34和無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)的種子進(jìn)行稻米品質(zhì)分析,測(cè)定糙米率、精米率、整精米率、堊白粒率、粒長(zhǎng)、粒寬。

    1.2.3 突變體Spl34對(duì)紫外光的反應(yīng) 前期葉片局部遮光試驗(yàn)表明自然光是誘導(dǎo)斑點(diǎn)出現(xiàn)的因素。紫外光是電磁波譜中波長(zhǎng)從0.01~0.40μm輻射的總稱(chēng),又是自然光中最重要的誘變因素,因此為了探究斑點(diǎn)的出現(xiàn)是否由紫外光引起,進(jìn)一步設(shè)計(jì)了紫外光處理試驗(yàn)。通過(guò)紫外光(UV)處理試驗(yàn)探究突變體Spl34對(duì)紫外光(UV)的反應(yīng),設(shè)置4個(gè)環(huán)境(A:-UV、8h光 照;B:-UV、12h光 照;C:+UV、8h光照;D:+UV、12h光照),放入相同長(zhǎng)勢(shì)的突變體Spl34和無(wú)斑點(diǎn)植株(CK),觀察植株生長(zhǎng)情況及斑點(diǎn)的發(fā)生情況,記錄斑點(diǎn)大小并在斑點(diǎn)出現(xiàn)和爆發(fā)時(shí)拍照。

    1.2.4 突變體Spl34的SPAD和可溶性蛋白測(cè)定SPAD(SPAD,Soil and plant analyzer development)是作物分析儀,SPAD值可以用來(lái)衡量葉片的綠色程度。本研究使用美能達(dá)葉綠素計(jì)SPAD-502(日本大阪美能達(dá)相機(jī)有限公司)測(cè)定植株葉片的SPAD值。田間條件下,在水稻開(kāi)花后選取長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的10個(gè)單株,每株測(cè)定具有代表性的5片劍葉,每個(gè)葉片重復(fù)測(cè)3次。植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類(lèi),其含量是了解植物總代謝的一個(gè)重要指標(biāo)。田間條件下,在水稻開(kāi)花后選取長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的5個(gè)單株,每株選取具有代表性的3片劍葉,混合作為可溶性蛋白提取的樣本材料,使用牛血清蛋白法測(cè)定[8]。

    1.2.5 突變體Spl34光合速率測(cè)定 為了解突變體Spl34的斑點(diǎn)是否影響水稻葉片的光合作用,在田間測(cè)量了開(kāi)花期突變體Spl34和無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)的各項(xiàng)光合作用指標(biāo)。田間條件下,在開(kāi)花期晴天上午9:00~11:00,取長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的突變體Spl34和無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)各10株,利用Li-6400XT型便攜式光合作用測(cè)定儀分別測(cè)定突變體Spl34和無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)葉片的各項(xiàng)光合作用指標(biāo)。每株測(cè)定具有代表性的5片劍葉,每葉重復(fù)測(cè)定3次;測(cè)量時(shí),使用紅、藍(lán)光源,光強(qiáng)恒定為 1200μmol/m2·s,溫度為30℃,CO2濃度為空氣中的濃度,濕度為大氣中的濕度[9]。

    1.2.6 突變體Spl34中H2O2和的檢測(cè) 在突變體Spl34中斑點(diǎn)的形成一般與ROS(主要是和H2O2)和自由基(主要是OH-)有關(guān)。二氨基聯(lián)苯胺(DAB,3,3′-Diaminobenzidine)被過(guò)氧化氫(H2O2)氧化生成不溶于水的暗棕色顆粒(紅棕色沉淀),四唑氮藍(lán)(NBT,Nitro blue tetrazolium)與超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)并形成深藍(lán)色不溶性甲瓚化合物,因此DAB和NBT可分別用于檢測(cè)H2O2和。突變體Spl34的斑點(diǎn)表型出現(xiàn)后,取突變體Spl34有斑點(diǎn)表型和無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)的葉片,分別采用DAB、NBT檢測(cè)葉片中斑點(diǎn)部位H2O2、的沉積情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 突變體Spl34表型及農(nóng)藝性狀鑒定 調(diào)查早季突變體Spl34植株田間生長(zhǎng)情況,分蘗期調(diào)查發(fā)現(xiàn)田間種植的突變體Spl34與無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)的株高和葉片生長(zhǎng)情況沒(méi)有差異(圖1)。突變體Spl34的斑點(diǎn)從幼穗分化期開(kāi)始一直持續(xù)到成熟期,屬于全生育期擴(kuò)散型斑點(diǎn)葉突變體;田間觀察發(fā)現(xiàn)突變體Spl34植株在成熟期沒(méi)有出現(xiàn)明顯的早衰現(xiàn)象(圖2a);突變體Spl34成熟期葉片斑點(diǎn)擴(kuò)散到了整個(gè)葉片(圖2b);突變體Spl34成熟期的稻穗、籽粒與無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)沒(méi)有明顯差異(圖2c、d)。結(jié)果表明,斑點(diǎn)葉突變體Spl34成熟期植株、稻穗、籽粒的表型性狀與無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)相比均未出現(xiàn)差異。

    圖1 分蘗期無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)與突變體Spl34的表型

    圖2 成熟期無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)與突變體Spl34的表型

    對(duì)突變體Spl34和無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)的株高、單株穗重、一次枝梗數(shù)、穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率、粒長(zhǎng)、粒寬、千粒重等農(nóng)藝性狀調(diào)查后,利用SAS(Statistical analysis system)生物統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,結(jié)果顯示突變體Spl34與無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)相比,各性狀差異不顯著(表1)。表明突變體Spl34的主要農(nóng)藝性狀未受到斑點(diǎn)性狀的不利影響。

    2.2 種子活力及品質(zhì)分析 種子活力測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果顯示,突變體Spl34的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別達(dá)到了 82.67%、91.33%,而無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)分別為69.30%、79.60%(圖 3)。突變體Spl34的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均高于無(wú)斑點(diǎn)植株(CK),差異達(dá)到極顯著水平。結(jié)果表明,突變體Spl34斑點(diǎn)表型的出現(xiàn)并未影響種子的活力,反而在一定程度上提高了突變體Spl34的種子活力。

    表1 突變體Spl34與無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)農(nóng)藝性狀鑒定

    圖3 突變體無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)與突變體Spl34的種子活力鑒定

    利用SAS軟件分析突變體Spl34和無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)的稻米品質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),突變體Spl34糙米率為84.00%,精米率為72.10%,堊白粒率為10.75%,均與無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)沒(méi)有明顯差異,而突變體Spl34整精米率為66.25%,高于無(wú)斑點(diǎn)植株(CK),兩者差異達(dá)極顯著水平(表2)。表明突變體Spl34稻米品質(zhì)未受到斑點(diǎn)性狀的不利影響。

    表2 突變體Spl34與無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)稻米品質(zhì)鑒定

    2.3 突變體Spl34對(duì)紫外光的反應(yīng) 紫外光(UV)輻照試驗(yàn)顯示:培養(yǎng)箱種植的植株,觀察發(fā)現(xiàn)突變體Spl34在輻照條件下16d葉尖開(kāi)始出現(xiàn)斑點(diǎn),而沒(méi)有輻照條件的葉尖則未出現(xiàn)斑點(diǎn)。對(duì)成熟期葉片斑點(diǎn)面積進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)輻照12h的突變體Spl34的葉片同樣大小區(qū)域內(nèi)(1cm2)斑點(diǎn)面積比輻照8h的要大(圖4)。此外,沒(méi)有輻照8h、12h條件下的培養(yǎng)箱中突變體Spl34的葉片均未出現(xiàn)斑點(diǎn)。因此可以推測(cè)紫外光(UV)是誘導(dǎo)斑點(diǎn)出現(xiàn)的因素,并且隨著照射時(shí)間的增加斑點(diǎn)面積也會(huì)變大,推測(cè)突變體Spl34的斑點(diǎn)可能是紫外光誘導(dǎo)某種未知色素的積累導(dǎo)致。

    圖4 UV對(duì)突變體Spl34的影響

    2.4 SPAD和可溶性蛋白含量測(cè)定 SPAD測(cè)定結(jié)果顯示,從開(kāi)花期開(kāi)始突變體Spl34的SPAD值就低于無(wú)斑點(diǎn)植株(CK),其下降速度也較快,開(kāi)花30d時(shí)突變體Spl34的SPAD值遠(yuǎn)低于無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)(圖5a)。在開(kāi)花期開(kāi)始時(shí)突變體Spl34的SPAD值為36.90,隨著開(kāi)花時(shí)間的推移SPAD值下降很快,開(kāi)花30d時(shí)已經(jīng)降至9.81;而無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)的SPAD值在開(kāi)花10d后開(kāi)始明顯下降,30d時(shí)降至25.01。

    在開(kāi)花期突變體Spl34葉片的可溶性蛋白含量均低于無(wú)斑點(diǎn)植株(CK),且突變體Spl34葉片的可溶性蛋白含量的下降速度大于無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)(圖5b)。突變體Spl34葉片的可溶性蛋白含量在開(kāi)花期開(kāi)始時(shí)是18.26mg/g(鮮葉),在開(kāi)花15d后下降速度變快,30d時(shí)降至5.90mg/g(鮮葉)。結(jié)果表明,突變體Spl34斑點(diǎn)的形成導(dǎo)致葉片葉色指標(biāo)迅速降低,隨著斑點(diǎn)出現(xiàn)的爆發(fā)下降速度增加。同時(shí)葉片中的可溶性蛋白也有同樣的下降趨勢(shì);可溶性蛋白大多是參與各種代謝的酶類(lèi),因此可以推測(cè)斑點(diǎn)的形成一定程度上降低了代謝酶活性,影響了突變體Spl34的代謝活動(dòng)。

    2.5 光合作用指標(biāo)的測(cè)定 光合作用指標(biāo)測(cè)量結(jié)果顯示,開(kāi)花期突變體Spl34的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Ts)分別為11.54μmol/m2·s、0.23mol/m2·s、301.50mmol/m2·s、4.26μ mol/m2·s;而無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)分別為17.70μmol/m2·s、0.26mol/m2·s、258.78mmol/m2·s、4.60μ mol/m2·s。從試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)開(kāi)花期突變體Spl34的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均低于無(wú)斑點(diǎn)植株(CK),其中凈光合速率差異性極顯著,而胞間CO2濃度則極顯著高于無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)(圖6)。表明突變體Spl34植株斑點(diǎn)的出現(xiàn)影響了水稻葉片的光合作用。2.6 H2O2和的檢測(cè) 為了進(jìn)一步了解突變體Spl34的抗活性氧(ROS)能力和抗逆性,設(shè)置了NBT、DAB的染色試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示,突變體Spl34葉片斑點(diǎn)部位經(jīng)NBT染色后仍是褐色,沒(méi)有出現(xiàn)藍(lán)-紫色沉淀(圖7a);經(jīng)DAB染色后,斑點(diǎn)部位并沒(méi)有明顯的黑褐色沉淀(圖7b)。結(jié)果表明,突變體Spl34斑點(diǎn)部位沒(méi)有大量積累和H2O2,因此推測(cè)突變體Spl34比無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)有更強(qiáng)的抗氧化能力。

    圖5 開(kāi)花期突變體Spl34與無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)的SPAD值和可溶性蛋白含量變化

    圖6 開(kāi)花期無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)與突變體Spl34劍葉的光合特性

    圖7 無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)與突變體Spl34的NBT、DAB染色反應(yīng)

    3 結(jié)論與討論

    在以往的報(bào)道中,大多數(shù)水稻突變體斑點(diǎn)性狀的出現(xiàn)都會(huì)影響農(nóng)藝性狀,如水稻斑點(diǎn)葉突變體spl28在分蘗期株高明顯低于野生型,表現(xiàn)出嚴(yán)重的早衰現(xiàn)象[11];水稻突變體lbsl1與野生型相比,株高、結(jié)實(shí)率和千粒重等性狀均有降低[2]。突變體Spl34植株在成熟期沒(méi)有明顯的早衰現(xiàn)象,多個(gè)農(nóng)藝性狀也無(wú)顯著差異。稻米品質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)突變體Spl34與無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)的整精米率差異達(dá)到極顯著水平,其他指標(biāo)沒(méi)有顯著性差異。紫外光照射試驗(yàn)表明,突變體Spl34的斑點(diǎn)可能是紫外光誘導(dǎo)某種未知色素積累導(dǎo)致,未知色素的積累可能影響葉片的光合作用。SPAD值和可溶性蛋白含量的測(cè)定結(jié)果顯示突變體Spl34的SPAD值、可溶性蛋白含量均低于無(wú)斑點(diǎn)植株(CK),且下降速度較快。田間光合作用測(cè)定結(jié)果表明氣孔導(dǎo)度降低,蒸騰作用減弱,胞間CO2濃度積累,最終導(dǎo)致葉片的光合速率降低,因此影響葉片的光合作用。NBT、DAB染色試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明突變體Spl34斑點(diǎn)部位沒(méi)有和H2O2沉積,斑點(diǎn)葉突變體Spl34比無(wú)斑點(diǎn)植株(CK)有更強(qiáng)的抗氧化能力。

    發(fā)掘和鑒定各式各樣的葉色突變體,不僅有助于葉綠素合成與降解、光合作用機(jī)理等的研究,對(duì)水稻品種改良、抗病性研究也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。突變體出現(xiàn)類(lèi)病變突變的原因非常復(fù)雜,如水稻類(lèi)病斑突變體spl7在高溫(>35℃)和紫外線(xiàn)的誘導(dǎo)下產(chǎn)生斑點(diǎn)[12];突變體lmm4類(lèi)病斑表型受自然光照的誘導(dǎo)[13]。本研究的紫外光誘導(dǎo)試驗(yàn)表明突變體Spl34斑點(diǎn)形成的誘導(dǎo)因素是紫外光,開(kāi)花期是突變體Spl34斑點(diǎn)爆發(fā)的時(shí)間段;光合作用指標(biāo)測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明突變體Spl34植株斑點(diǎn)的出現(xiàn)影響葉片的光合作用。目前關(guān)于細(xì)胞死亡類(lèi)水稻斑點(diǎn)葉突變體的研究報(bào)道很多,如spl11[14]、spl28[11]以及最新發(fā)現(xiàn)的spl32[15]和spl33[16]等。一類(lèi)由色素積累導(dǎo)致的斑點(diǎn)葉突變體還少有報(bào)道,已經(jīng)報(bào)道的spl30突變體出現(xiàn)的紅棕色斑點(diǎn)并非是由細(xì)胞死亡引起,而是未知色素的積累[3]。本研究中突變體Spl34也是一份特殊的非細(xì)胞死亡型斑點(diǎn)葉突變體,具有較好的研究應(yīng)用價(jià)值;此外,發(fā)掘新的水稻斑點(diǎn)葉突變體對(duì)增強(qiáng)植株抗病性及對(duì)抗病反應(yīng)的認(rèn)知具有重要的意義。

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