根據(jù)WS/T 505-2017文件對血清梅毒抗體ELISA定性方法性能驗(yàn)證

曹玉亭 郭長青（通訊作者） 王海永 楊學(xué)文

（1 南湖社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科 江蘇 南京 210017）

（2 江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科 江蘇 南京 210029）

梅毒是一種常見的慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病，由梅毒螺旋體引起，可經(jīng)性接觸、輸血、母嬰垂直等途徑傳播，嚴(yán)重危害到患者的正常工作與生活，梅毒臨床上常表現(xiàn)為三期，其進(jìn)展與癥狀非常復(fù)雜，而實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果為臨床醫(yī)生診治的重要依據(jù)，常用的實(shí)驗(yàn)診斷方法有多種，主要分為定性與定量兩大類，相比定量方法，定性方法有檢測迅速、靈敏度高、應(yīng)用廣泛、方法學(xué)較成熟、成本低等優(yōu)點(diǎn)。TP-ELISA是以梅毒螺旋體抗原包被聚丙乙烯板，再加入待檢血清以及酶標(biāo)抗原，形成雙抗原夾心，同時(shí)檢測IgG、IgM抗體。我科ISO15189復(fù)評審在即，現(xiàn)根據(jù)WS/T 505-2017文件，對本科室梅毒抗體定性方法TP-ELISA分析性能進(jìn)行驗(yàn)證。

1.材料與方法

1.1 檢測系統(tǒng)

Tecan公司的FREEDOM EVOLYZER-2全自動(dòng)酶標(biāo)儀，英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司生產(chǎn)的診斷試劑盒（雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法），質(zhì)控品為北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的梅毒螺旋體抗體定值質(zhì)控血清和本室留取的陰性混合血清，及相關(guān)耗材。

1.2 標(biāo)本來源

收集江蘇省中醫(yī)院2017年已經(jīng)臨床確診，且經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測確定梅毒抗體A值的患者血清標(biāo)本，用本院體檢正常血清將該原始血清分別稀釋5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍制成多個(gè)低抗體滴度梯度標(biāo)本。

1.3 操作人員

經(jīng)過驗(yàn)證方案培訓(xùn)，并經(jīng)科主任崗位授權(quán)的技術(shù)工作人員。

1.4 方法

（1）請廠家工程師對儀器進(jìn)行校驗(yàn)，使儀器各項(xiàng)功能使用均正常。

（2）臨界值的驗(yàn)證

酶標(biāo)儀上每標(biāo)本重復(fù)測定40次并記錄A值，以廠家提供的CUTOFF值判斷陰陽性，取陽性結(jié)果數(shù)與陰性結(jié)果數(shù)大致相當(dāng)?shù)臉?biāo)本濃度為C50，再以原始血清標(biāo)本稀釋制成C50-20%與C50+20%兩份標(biāo)本；以上兩份標(biāo)本各在酶標(biāo)儀上重復(fù)測定100次，分別統(tǒng)計(jì)陽性與陰性結(jié)果數(shù)，如表2。

（3）陰性與陽性符合率的驗(yàn)證

對低于C50-20%的標(biāo)本與高于C50+20%的標(biāo)本分別用酶標(biāo)儀和化學(xué)發(fā)光儀測定，以前者為測得結(jié)果，后者為最終結(jié)果，兩者結(jié)果比較，計(jì)算陰性與陽性符合率。

主要是依據(jù)WS/T 505-2017文件中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1）臨界值：若C50±20%包括C5～C95，則符合要求。

2）精密度：若不精密度在文件規(guī)定的允許范圍內(nèi)，則符合要求。

3）陰、陽性符合率：測得結(jié)果與最終結(jié)果一致程度。

2.結(jié)果判定

對各梯度濃度標(biāo)本重復(fù)測定后，結(jié)果在稀釋倍數(shù)為35和40時(shí)，陽性結(jié)果數(shù)分別為29和12，根據(jù)WS/T 505-2017文件，C50對應(yīng)的稀釋倍數(shù)應(yīng)在35和40之間，見表1，用原始血清分別作36倍、37倍、38倍及39倍稀釋，并在酶標(biāo)儀上測定此四濃度標(biāo)本梅毒抗體吸光度A值，最終確定稀釋38倍標(biāo)本吸光度為0.172對應(yīng)的標(biāo)本抗體濃度為C50，計(jì)算得C50-20%和C50+20%對應(yīng)的吸光度分別為0.136和0.204。C50-20%濃度（0.136）100次重復(fù)測定結(jié)果陽性百分率為4%，小于5%；C50+20%濃度（0.204）100次重復(fù)測定結(jié)果陽性百分率為98%，大于95%，如表2。根據(jù)文件要求，說明廠家提供的檢測項(xiàng)目臨界值可靠。

表1 C50值的確定

表2 陰/陽性百分率

3.討論

正常人體感染梅毒螺旋體后4～10周左右，血清中可產(chǎn)生抗梅毒螺旋體抗體，定性測定抗梅毒抗體主要用于快速篩檢與排除梅毒患者。臨床實(shí)驗(yàn)室使用的定性試劑，廠家都提供了檢測臨界值、靈敏度、精密度以及陰陽特異性等參數(shù)，但這些參數(shù)均是廠家在最佳實(shí)驗(yàn)條件下獲得給定的，臨床實(shí)驗(yàn)室由于實(shí)驗(yàn)條件與環(huán)境的差異，需按各自的檢測系統(tǒng)進(jìn)行性能評價(jià)并確定自己的性能參數(shù)。