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    浮萍休眠體形成過程中的淀粉積累

    2018-12-19 08:52:24史慧娟肖國華劉存歧
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年22期
    關(guān)鍵詞:浮萍淀粉酶葉綠素

    趙 昭, 史慧娟, 張 楠,肖國華, 劉存歧, 金 磊

    (1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071002; 2.河北大學(xué)博物館,河北保定 071002;3.河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院,河北秦皇島 066200)

    浮萍在世界上主要有多根紫萍屬(Spirodela)、少根紫萍屬(Landoltia)、浮萍屬(Lemna)、扁平無根萍屬(Wolffiella)、蕪萍屬(Wolffia)5屬40種[1],而在我國主要有3屬7種[2],是一種世界廣泛分布、在人工濕地建設(shè)較好的水生植物[3],主要生活在靜止或流動緩慢的淡水中,能夠降解污染物,吸收氮磷、降解重金屬[4]。浮萍是一種形態(tài)高度退化的高等被子植物,僅有葉狀體和根,其中葉狀體是浮萍進(jìn)行光合作用的主要器官,而休眠體是浮萍在生長周期過程中重要的生命階段,體積小、沒有氣孔、細(xì)胞壁厚、淀粉含量高[5],在形態(tài)學(xué)上與葉狀體有很大不同,能夠使浮萍抵御外界的惡劣環(huán)境[6]。在自然環(huán)境中,浮萍大多數(shù)種類能夠在夏季末期產(chǎn)生一種休眠體,并沉降到水體底部不再生長,當(dāng)經(jīng)過寒冷的冬天刺激及春天溫度升高時,其能夠浮上水面并利用儲藏的淀粉發(fā)芽而生長成葉狀體[7]。在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中,低溫、脫落酸(ABA)及N、S、P等營養(yǎng)元素的缺乏也能誘導(dǎo)浮萍形成休眠體[6]。浮萍又是一種潛在的能源植物,生長速度快,每2~3 d可實(shí)現(xiàn)生物量翻倍[8],最高的生長速度可達(dá)到干質(zhì)量12.4 g/(m2·d),而浮萍在不同的生長環(huán)境下淀粉含量差異較大,可占到干質(zhì)量的3%~75%[5,9]。浮萍可經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生乙醇,產(chǎn)量達(dá)到6.42×103L/hm2,比同等條件下玉米生產(chǎn)的乙醇產(chǎn)量高50%[10],與玉米、甘薯等傳統(tǒng)能源植物相比,浮萍還可以凈化豬場污水和重金屬污染的水體,不會占用大量耕地,不會造成糧食危機(jī)[2,11]。

    目前,有關(guān)植物淀粉合成和降解途徑的研究較多,而有關(guān)浮萍在形成休眠體過程中淀粉的積累機(jī)制研究相對較少。有研究表明,植物葉片通過光合作用產(chǎn)生暫時性淀粉,并通過降解產(chǎn)生蔗糖,提供淀粉合成的原材料;蔗糖在蔗糖合成酶的作用下分解為果糖、UDP-葡萄糖,進(jìn)一步形成6-磷酸葡萄糖或1-磷酸葡萄糖;6-磷酸葡萄糖在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)的作用下形成葡聚糖鏈,在淀粉合成酶和淀粉分支酶的作用下形成直鏈淀粉和支鏈淀粉,AGPase是淀粉合成的限速酶[12],其活性受到抑制將導(dǎo)致淀粉合成途徑部分和全部終止,其活性或表達(dá)量的升高將會促進(jìn)淀粉的合成[13-14]。淀粉的分解途徑主要是在α、β-淀粉酶和糖化酶的作用下,水解直鏈淀粉和支鏈淀粉形成葡萄糖[15]。本試驗(yàn)采用ABA誘導(dǎo)紫萍(S.polyrrhiza)形成休眠體,研究其淀粉合成和降解途徑相關(guān)酶的活性及葉綠素含量變化,以揭示浮萍休眠體形成過程中影響淀粉含量變化的因素,為其進(jìn)一步開發(fā)利用奠定理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 休眠體與葉狀體的獲得

    紫萍NJ016取自四川大學(xué)荷花池,1% NaClO處理60~90 s,無菌水清洗2~3次;轉(zhuǎn)移到無菌營養(yǎng)液中,使用Wang等描述的方法[5]誘導(dǎo)紫萍形成休眠體并進(jìn)行收集;無菌條件下,將休眠體培養(yǎng)在含100 mL霍格蘭氏(Hoagland’s)營養(yǎng)液的250 mL鄂倫麥爾(Erlenmeyer)三角瓶中,置于溫度為 (25±1) ℃、光照度為7 000 lx、光—暗周期為16 h—8 h的溫室中培養(yǎng)7 d,即得由休眠體產(chǎn)生的第1代大小相同的葉狀體。

    1.2 試驗(yàn)處理

    將葉狀體在無菌條件下轉(zhuǎn)接到含1%蔗糖、pH值為5.8的Hoagland’s營養(yǎng)液中,置于溫度為(25±1) ℃、光照度為 7 000 lx、光—暗周期為16 h—8 h的溫室中培養(yǎng)3 d,加入 1 μmol/L ABA,分別收集ABA處理前(0 d)及ABA處理1、2、3、5 d時的葉狀體。ABA處理7 d時,可從葉狀體中分離收集到休眠體。

    1.3 測定內(nèi)容與方法

    1.3.1 淀粉含量 將干燥葉狀體或休眠體進(jìn)行研磨,取干粉0.3 g,加入3 mL 6 mol/L HCl,沸水浴處理2 h,用6 mol/L HCl或6 mol/L KOH調(diào)節(jié)pH值到7.0±0.5;加入200 μL Pb(COOH)2沉淀蛋白,5 000 r/min離心5 min,取上清液,高效液相色譜法(HPLC法)測定葡萄糖含量,計算淀粉含量,公式[16]為:

    淀粉含量=葡萄糖含量×0.909。

    1.3.2 葉綠素含量 稱取葉狀體或休眠體鮮質(zhì)量1 g,加入丙酮、乙醇配比為1 ∶1的反應(yīng)液萃取72 h,酶標(biāo)儀上分別測定波長為663、645 nm的吸光度,葉綠素濃度按照張憲政的方法[17]計算。

    1.3.3 AGPase酶活性和α、β-淀粉酶活性

    1.3.3.1 粗酶液的提取[18]稱取葉狀體或休眠體鮮質(zhì)量 0.5 g,加入pH值為7.5,含100 mmol/L HEPES-NaOH、8 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA、12.5%甘油(體積分?jǐn)?shù))、10 mg/L PVP-40、50 mmo1/L 2-巰基乙醇的提取液5 mL,研缽中研磨;12 000 r/min離心10 min,上清液即為粗酶液。所有操作步驟均在冰上進(jìn)行。

    1.3.3.2 AGPase酶和α、β-淀粉酶活性的測定 采用分光光度計法[19]測定AGPase酶和α、β-淀粉酶的活性。測定AGPase酶活性時,取20 μL粗酶液,加入110 μL pH值為 7.4,含100 mmol/L HEPES-NaOH、1.2 mmol/L ADPG、3 mmol/L PPi、5 mmol/L MgCl2、4 mmol/L DTT的反應(yīng)液,30 ℃ 反應(yīng)20 min后沸水浴30 s終止反應(yīng),10 000 r/min離心10 min;取上清液100 μL,加入5.2 μL含5.76 mmol/L NADP、0.08 U P-gucomutase(磷酸葡萄糖變位酶)、0.07 U G6P-脫氫酶的比色液,30 ℃反應(yīng)10 min;以20 μL煮沸的酶粗液作為對照,測定波長為340 nm的吸光度。AGPase活性單位定義為U,1 U代表單位質(zhì)量(1 mg)的酶在波長340 nm處1 min反應(yīng)液的吸光度值增加0.01。

    測定α、β-淀粉酶活性時,首先制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:麥芽糖溶液與3,5-二硝基水楊酸(DNS)沸水浴反應(yīng)5 min,冷卻,測定波長為520 nm處的吸光度,并建立以吸光度為縱坐標(biāo)、麥芽糖含量為橫坐標(biāo)的回歸方程。其次,測定總淀粉酶活性:取10 mL試管2支,分別加入各1 mL的粗酶液、檸檬酸緩沖液;分別加入4 mL 0.4 mol/L NaOH,37 ℃水浴10 min后各加入37 ℃預(yù)熱的1%可溶性淀粉2 mL,水浴5 min,在含粗酶液的試管中加入4 mL 0.4 mol/L NaOH終止酶反應(yīng);取 10 mL 刻度試管3支,分別加入蒸餾水、粗酶液處理液、檸檬酸緩沖液處理液2 mL;每管加入3,5-二硝基水楊酸溶液 2 mL,沸水浴準(zhǔn)確煮沸5 min;取出冷卻,加入10 mL蒸餾水,搖勻,波長525 nm處測定吸光度;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出麥芽糖濃度、總淀粉酶活性。最后,測定α、β-淀粉酶活性:粗酶液70 ℃保溫15 min,再按照總淀粉酶活性的測定方法測得α-淀粉酶活性,則得β-淀粉酶活性=總淀粉酶活性-α-淀粉酶活性。1個α、β-淀粉酶活性單位定義為單位質(zhì)量(1 mg)的酶 1 min 催化底物所釋放1 nmol麥芽糖。

    1.3.4 蛋白含量 按照Appenroth等的方法[20]測定。將粗酶液稀釋10倍;取稀釋的酶液1 mL,加入5 mL考馬斯亮蘭 G-250溶液,充分搖勻,靜置2 min,測定波長595 nm處的吸光度,根據(jù)以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白含量。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    釆用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析;采用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖;采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 浮萍休眠體形成過程中淀粉含量及生長速度的變化

    試驗(yàn)結(jié)果表明,浮萍休眠體呈暗綠色,邊緣較厚。由圖1可見,ABA處理0~1 d即浮萍休眠體形成前期,葉狀體數(shù)量由32個增加到50個,生長迅速;ABA處理1~2 d,浮萍葉狀體數(shù)目略有增加,到57個,生長速度增加趨緩;ABA處理3~7 d,浮萍的葉狀體數(shù)量減少,葉狀體繁殖受到一定抑制。由圖2可見,ABA處理0~3 d,浮萍葉狀體淀粉含量由20.9%緩慢增加到26.5%;ABA處理3~5 d,浮萍葉狀體出現(xiàn)較為快速的淀粉積累,淀粉含量由26.5%增加到36.7%;ABA處理7 d即形成休眠體時,休眠體中的淀粉含量迅速達(dá)到 65.0%。由此可見,浮萍在休眠體形成過程中,浮萍的生長受到抑制,對糖類的利用降低,從而將更多的糖儲存起來,淀粉積累是休眠體形成過程中最明顯的特征。

    2.2 浮萍休眠體形成過程中葉綠素含量的變化

    光合色素含量高低對浮萍光合作用強(qiáng)弱、淀粉積累多少具有重要的作用。由圖3、圖4可見,在浮萍休眠體形成過程中,葉狀體光合色素葉綠素a(chl a)、葉綠素b(chl b)含量呈下降趨勢,與葉綠素a含量相比,葉綠素b含量下降程度相對更大,葉綠素a、葉綠素b比值呈上升趨勢;ABA處理0~2 d即浮萍休眠體形成前期,chl a含量基本保持不變,而chl b含量明顯下降;ABA處理2~5 d,浮萍葉狀體中的chl a、chl b含量均下降較快;浮萍休眠體(ABA處理7 d)時的光合色素含量明顯低于葉狀體中的含量。

    2.3 浮萍休眠體形成過程中AGpase活性的變化

    AGPase是淀粉合成的關(guān)鍵酶和限速酶,能催化ATP和葡萄糖合成ADP-葡糖糖,而ADP-葡萄糖又是合成直鏈淀粉和支鏈淀粉的底物。由圖5可見,ABA處理0~2 d,浮萍AGPase活性明顯增加,AGPase活性由19.5 U快速增加到33.5 U,并達(dá)到最大值,酶活性增加71.8%;后隨ABA處理時間的延長,AGPase活性下降,ABA處理3~5 d時AGPase活性為7.5 U左右;浮萍休眠體的AGPase活性為0.047 U,明顯低于葉狀體中的活性,較未經(jīng)ABA處理的葉狀體其活性下降99.8%。

    2.4 浮萍休眠體形成過程中α、β-淀粉酶活性的變化

    α、β-淀粉酶是淀粉水解的關(guān)鍵酶,并能將直鏈葡聚糖水解成麥芽糖。由圖6可見,在浮萍休眠體形成過程中,α、β- 淀粉酶活性整體呈下降趨勢;與初始葉狀體即未用ABA處理相比,ABA處理5 d時葉狀體α、β-淀粉酶活性分別下降22.4%、46.0%;ABA處理0~1 d即休眠體形成前期,α-淀粉酶活性基本保持不變,而β-淀粉酶活性有明顯增加;與葉狀體相比,浮萍休眠體中的α、β-淀粉酶活性明顯低于葉狀體,α、β-淀粉酶活性均受到不同程度的抑制。

    2.5 淀粉含量與AGpase、α-淀粉酶、β-淀粉酶活性的相關(guān)性分析

    由表1可見,在浮萍休眠體形成過程中,淀粉含量與AGPase活性呈不顯著負(fù)相關(guān),與α、β-淀粉酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為-0.965、-0.888;α-淀粉酶活性和β-淀粉酶活性呈不顯著正相關(guān)。

    3 結(jié)論與討論

    本試驗(yàn)通過ABA誘導(dǎo)紫萍葉狀體形成休眠體,研究此過程中葉狀體、休眠體中淀粉、葉綠素含量及ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、α-淀粉酶、β-淀粉酶的活性變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在浮萍形成休眠體過程中,葉狀體的生長繁殖受到一定的抑制,其淀粉含量有所增加,這可能是由于浮萍葉狀體生長速率的降低導(dǎo)致對糖類的利用降低,從而將更多的糖儲存起來,進(jìn)而導(dǎo)致淀粉的積累,AGPase活性在ABA處理2 d時有大幅度的增加,增幅達(dá)71.8%,但在休眠體時明顯下降,較未經(jīng)ABA處理的葉狀體其活性下降99.8%,與Wang等的研究結(jié)論[5]相吻合;淀粉酶α、β-淀粉酶的活性整體呈下降趨勢。通過相關(guān)性分析結(jié)果表明,在浮萍休眠體形成過程中,淀粉含量與淀粉酶活性高度相關(guān),淀粉含量與α、β-淀粉酶的相關(guān)系數(shù)分別高達(dá)-0.965、-0.888,達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)水平(P<0.01),淀粉含量與AGPase活性的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平。因此,浮萍休眠體主要通過抑制淀粉的降解來積累淀粉。

    表1 浮萍休眠體形成過程中淀粉含量與AGpase、α-淀粉酶、

    注:*、**分別代表兩因素之間顯著(P<0.05)、極顯著相關(guān)(P<0.01)。

    休眠體是浮萍生命周期中的一個重要階段,是浮萍儲存淀粉、抵御外界惡劣環(huán)境的一個重要器官,顯微鏡下可觀察到其帶有細(xì)微的根。浮萍休眠體相當(dāng)于陸生植物的種子,不同之處在于浮萍休眠體的形成是無性繁殖,而植物種子的形成主要通過有性繁殖。浮萍休眠體的形成主要受2個因素的影響:一種是激素,另一種是營養(yǎng)元素尤其是磷元素的缺乏。浮萍在經(jīng)過冬眠之后,在合適的溫度和光照條件下,細(xì)胞內(nèi)的碳水化合物會發(fā)生變化,并從2個分生側(cè)囊中生長出新的葉狀體。ABA是一種重要的植物激素,在植物逆境脅迫和調(diào)節(jié)植物種子休眠中發(fā)揮著重要的作用,能夠使植物更好地適應(yīng)惡劣環(huán)境,同時,ABA在植物體內(nèi)對糖類、淀粉的合成和運(yùn)輸也發(fā)揮著重要的作用。有研究表明,少根紫萍在磷缺乏形成休眠體過程中,其淀粉含量可以達(dá)到75%[21],相當(dāng)于谷類玉米、高粱、小麥種子的淀粉量[22];大米懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中,ABA能上調(diào)AGPase基因的表達(dá),而在種子萌發(fā)過程中,ABA會抑制GA誘導(dǎo)的α-淀粉酶基因表達(dá)和β-淀粉酶活性[15];低濃度(1 μmol/L)ABA能夠提高淀粉的合成,而高濃度(100 μmol/L)ABA反而會降低淀粉含量[23]。ABA對淀粉的合成發(fā)揮著重要的作用,有關(guān)浮萍葉狀體或休眠體中的淀粉與ABA含量的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

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