1株秸稈降解高溫菌的篩選、鑒定及堆肥應用

文亞雄， 譚石勇， 邱 堯， 劉 備， 楊麗麗， 劉 翔， 楊梅玉

(湖南泰谷生物科技股份有限公司農業(yè)生物技術研究院/農業(yè)部植物營養(yǎng)與生物肥料重點實驗室，湖南長沙 410300)

作物秸稈是農業(yè)生產中產生的一種大量廢棄物，我國是世界秸稈產量最高的國家之一，占全世界秸稈總量的30%左右[1]。我國每年產生的秸稈約有7億t，根據其氮、磷、鉀養(yǎng)分含量計算，相當于350多萬t氮肥，800多萬t鉀肥，80多萬t磷肥[2]。將秸稈還田是農田土壤有機質的重要來源，也可節(jié)約大量化肥的施用，然而我國秸稈還田率還不足50%，在國家明令禁止露天焚燒秸稈以前，約97%的秸稈被焚燒、堆積或者遺棄，極大地造成了資源的浪費，同時也嚴重污染了環(huán)境[3-4]。秸稈還田方式包括覆蓋還田、粉碎還田、堆肥還田及過腹還田等[5]，其中，前3種還田方式適用于大量秸稈的處理，但覆蓋還田和粉碎還田屬于直接還田，秸稈腐解速度慢，還易引發(fā)病蟲害[6-7]。通過堆肥方式將秸稈制成有機肥還田，不但能大量處理秸稈，還能加快秸稈的腐解，提高肥效，改良土壤，培肥地力，是解決我國當前有機肥短缺的有效途徑。

秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質素構成，約占秸稈干質量的80%，其中纖維素與木質素較難被分解[8]。在秸稈細胞中，木質素、纖維素與半纖維素等交聯(lián)沉積在細胞壁中，木質素還可通過多糖橋交聯(lián)影響微生物降解纖維多糖。細菌因其體積小、營養(yǎng)吸收面大、物質交換快等特點，常被用于堆肥生產[9]。針對秸稈中纖維素含量較高。堆肥過程中堆體內部溫度較高的特點，本研究通過篩選耐高溫產纖維素酶的微生物，進行秸稈崩解及堆肥試驗，以期篩選出簡單高效的秸稈堆肥菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 平菇菇渣，以木屑為主要原料，在自然堆積過程中可升溫至60 ℃以上。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基：秸稈10.0 g、蛋白胨5.0 g、KH2PO42.0 g、MgSO40.5 g、蒸餾水1 000 mL。純化培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基。羧甲基纖維素(CMC)鑒別培養(yǎng)基：CMC-Na 7.5 g、(NH4)2SO42.0 g、KH2PO41.0 g、NaCl 1.0 g、MgSO40.5 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH值自然。基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、KH2PO42.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH值自然。秸稈崩解培養(yǎng)基：水稻秸稈10.0 g，豆粕/尿素5.0 g，KH2PO42.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

微生物及堆肥試驗于2016年在湖南瀏陽農業(yè)部植物營養(yǎng)與生物肥料重點實驗室進行。

1.2.1 菌株篩選 稱取10.0 g菇渣樣品置于滅菌的 90.0 mL 富集培養(yǎng)基中，40 ℃搖床培養(yǎng)振蕩24 h，采用稀釋涂布法于 40 ℃ 條件下分離細菌。所得菌株分別點接于CMC鑒別培養(yǎng)基上，40 ℃ 恒溫培養(yǎng)。CMC鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株菌落出現后，倒入1.0 g/L剛果紅溶液染色1 h，倒出染色液，用 1.0 mol/L 的NaCl沖洗脫色，觀察菌落周圍有無纖維素水解圈，并測量水解圈直徑，將具有分解纖維素能力的菌株編號保存?zhèn)溆谩?/p>

將以上保存菌株分別接種于2種不同氮源(豆粕、尿素)的秸稈崩解培養(yǎng)基中，35 ℃振蕩培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)完成后過濾，將固體殘渣用蒸餾水沖洗，除去菌體，105 ℃烘干后稱質量，以不接菌為對照，采用失質量法計算秸稈降解率[10]。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學特征及部分生理生化特性 菌株純化后，觀察菌株在純化培養(yǎng)基上的菌落特征，并對細菌菌體進行革蘭氏染色鑒別，通過顯微鏡觀察菌株的形態(tài)特征，并根據《伯杰氏系統(tǒng)細菌手冊》(第2版)研究細菌的部分生理生化特征。

1.2.2.2 16S rDNA鑒定 將純化得到的菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定，細菌測序用通用引物16S F(5′-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S R(5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′)。將獲得的細菌DNA序列分別輸入到EzBioCloud中，用Identify程序與數據庫中的所有序列進行比較分析。并利用MEGA5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基初步優(yōu)化

1.2.3.1 菌株生長曲線測定 將活化菌株以2%的接種量分別接入裝有50 mL滅菌基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于35 ℃，160 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)期間每隔 2 h 取發(fā)酵液樣品，測定其吸光度(D600 nm)。換算倍數后以其代表發(fā)酵液菌體濃度，并以發(fā)酵時間及菌體濃度繪制菌株生長曲線。

1.2.3.2 不同碳源對發(fā)酵液菌體濃度的影響 分別以 10.0 g/L 糊精、甘露醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖替代基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源進行發(fā)酵試驗，于搖床35 ℃，160 r/min搖瓶中發(fā)酵20 h，測定發(fā)酵液吸光度(D600 nm)，比較不同碳源對發(fā)酵液菌體濃度的影響。

1.2.3.3 不同氮源對發(fā)酵液菌體濃度的影響 分別以 5.0 g/L 硝酸鈉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸銨、硫酸銨、尿素替代基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，以上述篩選的最佳碳源及濃度代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源進行發(fā)酵試驗，于35 ℃，160 r/min 條件下?lián)u瓶發(fā)酵20 h，測定發(fā)酵液吸光度(D600 nm)，比較不同氮源對發(fā)酵液菌體濃度的影響。

1.2.3.4 不同無機鹽對發(fā)酵液菌體濃度的影響 分別以 2.0 g/L 磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、硫酸鎂替代基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機鹽，以上述篩選的最佳碳、氮源及濃度代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳、氮源進行發(fā)酵試驗，于35 ℃，160 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵20 h，測定發(fā)酵液吸光度(D600 nm)，比較不同無機鹽對發(fā)酵液菌體濃度的影響。

1.2.3.5 不同無機鹽濃度對發(fā)酵液菌體濃度的影響 分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L磷酸二氫鉀替代基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機鹽，以上述篩選的最佳碳、氮源及濃度代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳、氮源進行發(fā)酵試驗，于35 ℃，160 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵20 h，測定發(fā)酵液吸光度(D600 nm)，確定合適的磷酸二氫鉀質量濃度。

1.2.3.6 不同碳氮比對發(fā)酵液菌體濃度的影響 分別以 10.0 g/L 淀粉，2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 g/L酵母膏及上述篩選得到的最佳無機鹽及濃度替代基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的各對應組分，35 ℃，160 r/min搖瓶發(fā)酵20 h，測定發(fā)酵液吸光度(D600 nm)，比較不同碳氮比對發(fā)酵液菌體濃度的影響。

1.2.3.7 最佳碳氮比下不同濃度碳氮源對發(fā)酵液菌體濃度的影響 將淀粉、酵母膏分別以(1)5.0、6.25 g/L；(2)10.0、12.5 g/L；(3)20.0、25.0 g/L；(4)30.0、37.5 g/L；(5)40.0、50.0 g/L；(6)50.0、62.5 g/L的濃度添加，無機鹽為上述篩選得到的最佳無機鹽及濃度，于35 ℃，160 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵20 h，測定發(fā)酵液吸光度(D600 nm)，確定各碳氮比下碳氮源的質量濃度。

1.2.4 秸稈堆肥驗證 堆肥炎癥試驗設置為處理1：玉米秸稈38.0 kg、菜粕2.0 kg、試驗菌劑；處理2：玉米秸稈38.0 kg、菜粕1.0 kg、尿素1.0 kg、試驗菌劑；CK：玉米秸稈38.0 kg、菜粕2.0 kg、市售EM菌劑。

堆肥菌劑：試驗菌劑為篩選得到細菌的發(fā)酵液，接種量以干物質計，細菌為2.5×1011CFU/kg；市售EM菌劑由滄州旺發(fā)生物技術研究所有限公司提供，接種量為2.4×1011CFU/kg。

將各物料及菌劑加水混勻，初始水分含量為60%。堆肥開始后，每天測定堆內溫度，定期翻堆，堆肥結束后測定各堆肥樣品的有機質含量，另各取10.0 g堆肥樣品，加水至 50.0 mL，振蕩1 h過濾，取濾液進行油菜種子發(fā)芽率試驗，以蒸餾水為對照，測定種子發(fā)芽率及發(fā)芽指數(GI)[11]。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

以CMC鑒別培養(yǎng)基從菇渣中分離到3株高溫產纖維素酶的細菌，將菌株分別接種于2種不同氮源的秸稈崩解培養(yǎng)基，35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，測量細菌，水解圈大小(水解圈直徑-菌落直徑，D-d)。從表1可以看出，3株細菌均具有不同程度的纖維素酶活性，可見明顯的水解圈，其中以G2水解圈最大。由圖1可知，3株細菌均對秸稈具有不同程度的降解效果，以豆粕為氮源的秸稈崩解效果優(yōu)于以尿素為氮源的處理，其中G2以豆粕為氮源的秸稈降解率最高，達14.59%。

表1 不同菌株水解圈大小

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學和相關生理生化特性 菌株G2在純化培養(yǎng)基平板上的菌落中間有凸起，白色，表面褶皺不規(guī)則，革蘭氏染色呈陽性。菌株G2相關生理生化特性見表2。

表2 G2相關生理生化特征

注：“+”“-”分別表示反應陽性、反應陰性；V-P表示乙酰甲基甲醇試驗；MR表示甲基紅試驗。

2.2.2 DNA鑒定 以細菌菌株G2基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA基因通用引物進行PCR擴增，成功擴增出長約1.3 kb的DNA片段，將細菌測序結果輸入到Ezbiocloud中進行Identify比對分析，從比對結果中選取同源性較高的菌株，用MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果(圖2)表明，G2與芽孢桿菌屬(Bacillus)的多個菌株具有同源性，其中與BacillussiamensisKCTC 13613的遺傳距離最近，同源性達99%。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基初步優(yōu)化

2.3.1 菌株生長曲線測定 從圖3可以看出，0～4 h為G2的生長停滯期；4 h以后進入對數生長期，菌體數量增長快速；14 h 后進入穩(wěn)定期，菌體濃度穩(wěn)定，變化??；24 h 后進入衰亡期，菌體濃度開始下降。由此可知，種子液發(fā)酵時間可選擇為12～14 h，該時期細菌生長旺盛，且菌體濃度較高；而測定最高菌體濃度可選擇發(fā)酵時間為16～24h，該時期菌體濃度最高且穩(wěn)定。

2.3.2 不同碳源對G2發(fā)酵液菌體濃度的影響 從圖4可以看出，在糊精、甘露醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖6種碳源中，以淀粉作碳源時，G2菌體濃度最高，因此選擇淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

2.3.3 不同氮源對G2發(fā)酵液菌體濃度的影響 從圖5可以看出，有機氮源處理G2的菌體濃度明顯高于無機氮源，其中以酵母膏作氮源時，G2菌體濃度最高，因此選擇酵母膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.3.4 不同無機鹽對G2發(fā)酵液菌體濃度的影響 從圖6可以看出，不同無機鹽對G2菌體濃度的影響差異較小，其中以磷酸二氫鉀作無機鹽時，細菌G2菌體濃度最高，因此選擇磷酸二氫鉀作為發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽。

2.3.5 不同無機鹽濃度對G2發(fā)酵液菌體濃度的影響 從圖7可以看出，磷酸二氫鉀濃度為1.0 g/L時，G2菌體濃度最高，而隨著磷酸二氫鉀添加量的提高，菌體濃度逐漸降低，因此磷酸二氫鉀濃度的最佳為1.0 g/L。

2.3.6 不同碳氮比對G2發(fā)酵液菌體濃度的影響 從圖8可以看出，隨著碳氮比的降低，G2菌體濃度呈先上升后下降的趨勢，當碳源、氮源濃度分別為10.0、12.5 g/L時，G2菌體濃度最高，因此選擇該比例作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比。

2.3.7 最佳碳氮比下不同濃度碳、氮源對G2發(fā)酵液菌體濃度的影響 從圖9可以看出，隨著碳、氮源濃度的增大，G2菌體濃度呈先上升后下降的趨勢，當碳源、氮源濃度分別為30.0、37.5 g/L時，G2菌體濃度最高D600 nm=10.395，較基礎發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵濃度(D600 nm=4.77)提高了117.92%，因此選擇該比例作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源濃度。由此得出，初步優(yōu)化的G2發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉 30.0 g/L，酵母膏 37.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L。

2.4 秸稈堆肥驗證試驗

選取降解秸稈效果最佳的G2進行不同秸稈堆肥試驗，測定堆內溫度、有機質含量及腐熟后種子發(fā)芽率。

2.4.1 溫度 好氧堆肥過程一般可分為升溫期、高溫期、降溫期3個時期。從圖10可以看出，不同試驗處理堆內溫度表現出上升、平穩(wěn)、下降的趨勢，試驗處理在1 d內均達到了 50 ℃ 及以上，第2天不同處理均達到了60 ℃以上，60 ℃以上溫度持續(xù)時間均達到5 d及以上，符合堆肥無害化處理的標準。處理1、處理2第1天溫度分別達到56、50 ℃，分別較對照處理高14、8 ℃；處理1最高溫度達68 ℃，較其他2處理高3 ℃，高溫持續(xù)時間也較其他處理長1 d。處理1與對照處理堆肥物料相同，而堆肥菌劑不同，說明試驗菌劑較該市售菌劑更適用于玉米秸稈堆肥；處理1與處理2所用氮源不同，說明有機氮源更適合于微生物生長，這也進一步驗證了秸稈崩解試驗的結論。

2.4.2 理化指標 從表3可以看出，不同處理的有機質含量均有減少，說明堆肥原料中的部分有機質被微生物分解，其中，處理1堆肥結束后有機質含量最低，說明試驗菌劑對玉米秸稈的降解能力優(yōu)于市售菌劑，但使用無機氮源時效果稍差。GI常用于評價堆肥腐熟度，能直接反應堆肥的腐熟狀態(tài)，當GI指數達到80%～85%時，表明堆肥對植物沒有毒性，已經腐熟[12-13]。從表4可以看出，處理1的GI指數已大大高出腐熟標準，說明腐熟秸稈已完全腐熟，且對植物沒有毒性[14]，此外試驗處理的種子平均根長平均值大于對照處理，說明該腐熟秸稈的浸提液可促進植物的生長。

表3 不同處理有機質含量

表4 種子發(fā)芽率及GI指數

3 討論

秸稈的資源化利用已成為國家提出的“一控、兩減、三基本”目標之一，秸稈堆肥是秸稈資源化利用的重要方法，將越來越受到重視。目前，針對農作物秸稈堆肥的研究主要集中在工藝優(yōu)化和篩選降解秸稈的高溫菌等方面[15]，尤以產木質纖維素酶高溫菌的篩選多見報道。高溫菌在堆肥過程中代謝快、活性高、酶的熱穩(wěn)定性高，可有效提高堆肥效率[16-17]。秸稈的主要成分包括纖維素、半纖維素及木質素，該類物質較難降解，篩選產相關酶系的微生物可有效分解秸稈中的難降解成分，加快堆肥的腐熟，因此，篩選該類高溫菌一般以酶活性為篩選條件。但由于酶活性的測定方法、條件以及酶活性單位的定義等比較多樣化，因此不同報道中的菌株酶活性參考性不大，而酶活性的測定誤差也較難控制，且對多菌復合的情況并不適用，不能很好反應菌株對秸稈降解的作用能力。失質量法是將微生物接入以秸稈為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)后計算秸稈的質量損失，得出秸稈的降解率。該方法簡單直接，可以直觀反映出微生物對秸稈的降解能力，并適用于多菌復合以及復合菌群的篩選，在工業(yè)生產上，可將失質量法得出的結果直接用于小試生產，可節(jié)約成本及時間。

發(fā)酵條件優(yōu)化試驗常用的設計方法有正交試驗設計法、響應面設計法等，一般是由單因素試驗確定試驗因素與水平，后經多因素設計試驗得出多因素試驗條件下的最優(yōu)組合。而常規(guī)的單因素試驗確定的碳、氮源濃度，并未考慮C/N的問題，確定最佳C、N濃度只是在基礎培養(yǎng)基的基礎上進行的，確定碳源氮源濃度的試驗中C/N各不相同，所得結果可能不是最優(yōu)濃度。如本試驗結果，以最佳C/N進行濃度試驗，相同C/N不同濃度的C、N存有優(yōu)化空間，所得結果應為最佳濃度。如本試驗不進行該項試驗，則單因素優(yōu)化的結果為C、N最佳濃度為10 g/L左右，與最佳結果相差較大，如進行正交優(yōu)化，則須進行多次試驗或不能得出最佳結果。本試驗只對發(fā)酵培養(yǎng)基進行了初步優(yōu)化，若要進行工業(yè)化生產，則應進一步對發(fā)酵條件等進行深入研究。