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    羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組SSR標(biāo)記信息分析

    2018-12-19 09:04:48王傳聰唐修陽(yáng)歐江濤
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年22期
    關(guān)鍵詞:沼蝦羅氏核苷酸

    王傳聰, 唐修陽(yáng), 項(xiàng) 杰, 歐江濤

    (鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院,江蘇鹽城 224051)

    羅氏沼蝦別稱(chēng)馬來(lái)西亞大蝦,隸屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱、十足目、長(zhǎng)臂蝦科、沼蝦屬。原產(chǎn)于南亞、東南亞以及大洋洲北部等地區(qū),生活在淡水或咸淡水水域,自然棲息于受潮汐影響的河口區(qū),是一種較大型的熱帶經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)[1],具有生長(zhǎng)快、肉質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分好以及養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點(diǎn),素有“淡水蝦王”之稱(chēng)[2]。然而,隨著集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展,一些嚴(yán)重的疾病已在羅氏沼蝦中流行,包括由新型病原——螺原體引起的2010年羅氏沼蝦螺原體病,引發(fā)大規(guī)模的死亡,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。這些水產(chǎn)動(dòng)物病害在帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益損失的同時(shí),也嚴(yán)重制約了羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。因此,及時(shí)開(kāi)展羅氏沼蝦的抗病研究是極為重要的。

    微衛(wèi)星標(biāo)記是目前最常用的分子標(biāo)記之一。由于與其他分子標(biāo)記相比,它具有保守性高、多態(tài)性豐富、在基因組中分布廣泛等特點(diǎn)[3],近年來(lái),在動(dòng)物遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析以及分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。目前在水生動(dòng)物的相關(guān)研究中,研究者已經(jīng)對(duì)牙鲆、二長(zhǎng)棘鯛、興國(guó)紅鯉、中國(guó)明對(duì)蝦等品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并基于測(cè)序結(jié)果對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入分析[4-7]。因此,開(kāi)展羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat,簡(jiǎn)稱(chēng)SSR)的研究具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本研究通過(guò)對(duì)羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,篩選出SSR位點(diǎn),對(duì)其進(jìn)行數(shù)量分析和多態(tài)性評(píng)價(jià)等,從而為羅氏沼蝦基因克隆、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析以及為羅氏沼蝦病害防治和選育種工作等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    羅氏沼蝦:購(gòu)于江蘇省南京市仙林農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),個(gè)體質(zhì)量在20~25 g,共計(jì)100尾,用PCR方法檢測(cè)螺原體,結(jié)果均呈陰性,在26~28 ℃水溫條件下養(yǎng)殖備用。螺原體MR-1008:分離于江蘇省高郵市自然發(fā)病的羅氏沼蝦,在R2液體培養(yǎng)基中于30 ℃孵育48 h,待其生長(zhǎng)到最具有侵染能力的對(duì)數(shù)期備用。

    1.2 總RNA提取

    采用TRIzol提取法提取羅氏沼蝦肝胰腺組織總RNA,提取產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢。質(zhì)檢合格的樣品保存在干冰中送往聯(lián)川生物公司進(jìn)行測(cè)序。

    1.3 RNA測(cè)序及組裝

    經(jīng)Illumina HiSeq2000/2500進(jìn)行測(cè)序,在健康羅氏沼蝦和螺原體感染羅氏沼蝦的肝胰腺組織中得到總mRNA原始數(shù)據(jù)(raw reads)分別為 53 070 612、61 244 504條,對(duì)raw reads進(jìn)行過(guò)濾得到有效數(shù)據(jù)(clean reads)分別為 52 757 004、60 719 728條(表1)。將得到的有效數(shù)據(jù)使用Trinity軟件進(jìn)行拼接,最終得到33 450條Unigenes(總長(zhǎng)度 29 327.225 kb)對(duì)應(yīng)43 405個(gè)轉(zhuǎn)錄本,長(zhǎng)度在200~2 000 bp之間的超過(guò)85%,符合基因轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度規(guī)律(表2)。

    表1 測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果

    注:Q20和Q30分別代表堿基被測(cè)錯(cuò)的概率P為1%和1‰,其計(jì)算公式為Q= -10lgP。GC為G和C的數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的百分比,用于檢測(cè)有無(wú)AT、GC分離現(xiàn)象。

    1.4 SSR標(biāo)記篩選

    SSR檢測(cè)是以組裝出來(lái)的Unigene作為參考序列,使用MISA軟件批量識(shí)別和定位所有SSR,然后對(duì)羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組SSR數(shù)據(jù)進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)分析。

    表2 拼接結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    注:N50表示將Unigenes從長(zhǎng)到短排序,依次累加Unigenes堿基數(shù)后,Unigenes總堿基數(shù)50%的Unigenes的長(zhǎng)度,轉(zhuǎn)錄本同。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的數(shù)量與分布

    對(duì)組裝所得的33 450條unigenes序列進(jìn)行比對(duì)篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)15 356個(gè)SSR位點(diǎn),分布在12 930條Unigenes上,發(fā)生頻率(含有SSR的Unigenes條數(shù)占總Unigenes條數(shù)的比例)為38.65%,其中10 504條Unigenes序列只含有單個(gè)SSR位點(diǎn),2 426條Unigenes序列含有2個(gè)或2個(gè)以上的SSR位點(diǎn)。由表3可知,羅氏沼蝦的SSR序列平均距離為1.91 kb,總長(zhǎng)度為230 820 bp,平均長(zhǎng)度為15 bp。

    羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中各種SSR出現(xiàn)頻率差異較大,各類(lèi)型出現(xiàn)的頻率不同,主要為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重復(fù)(圖1)。單核苷酸重復(fù)的SSR數(shù)量最多,其分布頻率為17.70%,占羅氏沼蝦總SSR的38.56%,其次為二核苷酸重復(fù),其分布頻率為16.53%,占羅氏沼蝦總SSR的36.00%,三核苷酸重復(fù)的SSR分布頻率為10.71%,占羅氏沼蝦總SSR的23.32%。四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)類(lèi)型的SSR類(lèi)型較少,分布頻率分別為0.53%、0.24%、0.21%,分別占羅氏沼蝦總SSR的1.15%、0.52%、0.45%。

    表3 SSR在羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)的頻率

    由表4可知,羅氏沼蝦SSR重復(fù)次數(shù)為5、6、7、12次的SSR位點(diǎn)較多,分別為2 245、4 540、1 647、1 796個(gè),分別占羅氏沼蝦總SSR的14.62%、29.56%、10.73%、11.70%,其次為重復(fù)8、13、14次的SSR位點(diǎn),分別為938、1 216、925個(gè),分別占總SSR的6.11%、7.92%、6.02%,重復(fù)次數(shù)≥16次的SSR位點(diǎn)相對(duì)較少,總共為1 277個(gè),占總SSR的8.32%。

    2.2 羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中SSR的特點(diǎn)

    羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中共搜索到512種不同序列類(lèi)型的SSR,其中單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)序列類(lèi)型分別有40、66、201、89、60、56種。單核苷酸中出現(xiàn)的重復(fù)類(lèi)型多為A/T,分別占羅氏沼蝦總SSR的39.33%,C/G類(lèi)型單核苷酸序列的SSR非常少。在二核苷酸重復(fù)中主要以GA/TC、AG/CT和AT/TA為主,分別為1 184、1 501、1 300個(gè),分別占二核苷酸重復(fù)SSR的21.42%、27.15%、23.52%,分別占羅氏沼蝦總SSR的7.71%、9.77%、8.47%。三核苷酸重復(fù)在羅氏沼蝦總SSR中的占比較大,其重復(fù)類(lèi)型見(jiàn)表5。各種三核苷酸重復(fù)類(lèi)型出現(xiàn)的數(shù)量差別較大,其中AAT/TTA出現(xiàn)的數(shù)量最多,為216個(gè),出現(xiàn)頻率為0.65%,占羅氏沼蝦總SSR的1.41%;其次為AAG/TTC、ATT/TAA、CCT/GGA、CTC/GAG、CTT/GAA,分別為204、187、197、191、215個(gè),分別占羅氏沼蝦總SSR的1.33%、1.22%、1.28%、1.24%、1.40%;其中CGG/GCC出現(xiàn)的數(shù)量最少,僅為8個(gè),占羅氏沼蝦總SSR的0.05%。

    2.3 羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組SSR多態(tài)性評(píng)價(jià)

    由圖2可知,羅氏沼蝦SSR重復(fù)長(zhǎng)度分布中重復(fù)長(zhǎng)度最小為12 bp,最大為25 bp,平均長(zhǎng)度為15 bp。其中重復(fù)長(zhǎng)度主要為12~16 bp及18 bp,占羅氏沼蝦總SSR的86.33%,其次是重復(fù)長(zhǎng)度為17 bp及20~22 bp,占羅氏沼蝦總SSR的11.91%,重復(fù)長(zhǎng)度在19 bp和≥23 bp的SSR位點(diǎn)數(shù)相對(duì)較少,分別僅占羅氏沼蝦總SSR的0.79%、0.96%。根據(jù)該結(jié)果,可推測(cè)該研究中Ⅱ型SSR(長(zhǎng)度為12~<20 bp)的比例為89.07%,具有中等多態(tài)性,有較高的潛在可用性。而具有高度多態(tài)性的Ⅰ型SSR(長(zhǎng)度≥20 bp)則較少。

    2.4 含SSR位點(diǎn)Unigene的功能注釋

    利用軟件對(duì)成功篩查到的SSR位點(diǎn)所在的12 930條Unigene序列進(jìn)行功能注釋。通過(guò)Blast比對(duì),有410個(gè)Unigene被注釋到NCBI Nr數(shù)據(jù)庫(kù)的已知序列,并呈現(xiàn)較高的相似性和同源性,但有96.83%的Unigene未得到任何注釋。

    表4 羅氏沼蝦SSR重復(fù)次數(shù)分布

    將15 356條SSR位點(diǎn)所在的12 930條Unigene序列注釋到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相關(guān)基因功能的預(yù)測(cè)和分類(lèi)。結(jié)果顯示其中的275條Unigene(2.13%)能夠在KOG找到相應(yīng)的注釋信息,根據(jù)其功能可以被分為22類(lèi)(圖3),并對(duì)其進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)。從分析結(jié)果可以看出,這275條被注釋的Unigene功能種類(lèi)較為全面,涉及大多數(shù)的生命活動(dòng)過(guò)程或功能?!耙话愎δ茴A(yù)測(cè)”是最大的一個(gè)分類(lèi),包含57條Unigene。其次是“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”“翻譯后修飾,蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn),分子伴侶”和“RNA加工和修飾”,分別包含34、26和19條Unigene?!昂私Y(jié)構(gòu)”這個(gè)分類(lèi)中包含的Unigene數(shù)最少,僅有1條。

    3 討論

    本研究通過(guò)IlluminaHiSeq2000/2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,從大量組裝所得轉(zhuǎn)錄組Unigene序列中篩選獲得15 356個(gè)SSR位點(diǎn)。相對(duì)于傳統(tǒng)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選方式,此方法篩選效率較高,工作量相對(duì)較小,適合大范圍開(kāi)拓SSR標(biāo)記位點(diǎn)[7]。

    SSR在整個(gè)基因組的不同位點(diǎn)都有分布,多態(tài)信息含量(polymorphism information content,簡(jiǎn)稱(chēng)PIC)起衡量基因位點(diǎn)多態(tài)性的作用,通常PIC能反映某個(gè)群體的遺傳變異程度、位點(diǎn)多樣性等[8]。另外SSR片段長(zhǎng)度也是判斷其多態(tài)性的重要依據(jù)[9]。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到的SSR中,重復(fù)序列長(zhǎng)度在12 bp以上的SSR標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)占總SSR數(shù)的76.95%,多態(tài)性較豐富,基于該研究結(jié)果能夠進(jìn)行有針對(duì)性的引物設(shè)計(jì)。在數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)定位研究及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建中,SSR多態(tài)性越高,所建立的圖譜越精密和精確,基因的定位越精準(zhǔn)[10-11]。

    隨著微衛(wèi)星輔助育種技術(shù)的廣泛應(yīng)用,通過(guò)遺傳操作培養(yǎng)出羅氏沼蝦抗病品種,是蝦病控制中一個(gè)值得選擇的方法。已有的研究表明,疾病發(fā)生時(shí)群體內(nèi)會(huì)有顯著的變異,通過(guò)微衛(wèi)星等標(biāo)記對(duì)發(fā)病動(dòng)物中死亡群體和存活群體的遺傳變異進(jìn)行研究,有望獲得與抗病性狀相連鎖的標(biāo)記,進(jìn)而對(duì)抗病基因進(jìn)行標(biāo)記和定位以培育出具有持久抗病能力的優(yōu)良品種[12]。

    本研究對(duì)羅氏沼蝦SSR的分布特征進(jìn)行分析,不僅在RNA水平上體現(xiàn)了羅氏沼蝦SSR的分布特點(diǎn)和規(guī)律,而且也為開(kāi)發(fā)羅氏沼蝦功能基因奠定了SSR分子標(biāo)記基礎(chǔ),同時(shí)也為羅氏沼蝦QTL定位、基因克隆、遺傳結(jié)構(gòu)分析及其他遺傳學(xué)研究提供了有效的分子標(biāo)記。

    表5 三核苷酸SSR不同重復(fù)單元的比例

    注:頻率為含有SSR的Unigenes數(shù)與總Unigenes數(shù)之比;占比為該重復(fù)基元SSR占總SSR的比例。

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