黑果腺肋花楸組織培養(yǎng)與快速繁殖

張成霞， 吳 紅， 劉 行， 居 濤， 李波廣， 王 瑞， 仲啟明， 湯庚國(guó)， 張衡鋒

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院園林園藝學(xué)院，江蘇泰州 225300； 2.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇南京 210037)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)是引自美國(guó)東部的一種薔薇科腺肋花楸屬的落葉灌木，其是集藥用、食用及城市綠化于一體的優(yōu)良樹(shù)種，耐貧瘠、掛果早、經(jīng)濟(jì)效益高，有很大的市場(chǎng)前景[1]。1990年以后陸續(xù)被引入我國(guó)東北，并定植于遼西地區(qū)[2]。由于其樹(shù)形優(yōu)美、觀(guān)賞期長(zhǎng)，是春觀(guān)葉、夏觀(guān)花、秋觀(guān)果的優(yōu)質(zhì)綠化樹(shù)種[3]，可孤植也可在公園、路旁等城市綠地中大量種植[4]。黑果腺肋花楸鮮果中黃酮類(lèi)物質(zhì)較高，果實(shí)富含花青素、多酚、胡蘿卜素等[5]，對(duì)心血管疾病具有特殊療效，且具有抗衰老功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和功能食品工業(yè)[6]；同時(shí)，黑果腺肋花楸抗旱、抗寒能力強(qiáng)，且生長(zhǎng)所需水分很少，故在降水較少的干旱地區(qū)也完全可以存活，極限低溫-40 ℃以上的氣候也能正常生長(zhǎng)發(fā)育[3，7]。黑果腺肋花楸根系為淺根性，水平根發(fā)達(dá)，枝條萌蘗能力強(qiáng)，對(duì)30～40 cm 土層的固定力強(qiáng)，病蟲(chóng)害極少，對(duì)風(fēng)害、冰雹等自然災(zāi)害抗性強(qiáng)，保持水土效果較好，生態(tài)能力強(qiáng)[8]。當(dāng)前黑果腺肋花楸種苗的市場(chǎng)需求量大，由于傳統(tǒng)播種繁殖和扦插育苗速度緩慢且實(shí)施困難，采用組織培養(yǎng)方法加可快其繁殖速度，能在短時(shí)間內(nèi)獲取大量組培苗，滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)其種苗的需求。國(guó)內(nèi)有關(guān)黑果腺肋花楸組培快繁的研究報(bào)道僅局限于原生質(zhì)體、胚乳愈傷組織、組培苗瓶外生根、不定芽的誘導(dǎo)與增殖等方面[8-12]，對(duì)不同外植體誘導(dǎo)的篩選、增殖、組培苗生根和馴化移栽等研究尚未見(jiàn)報(bào)道，故本研究以黑果腺肋花楸為材料，選擇不同種類(lèi)的外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)快繁體系研究，擬篩選出適宜黑果腺肋花楸快繁的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合，為進(jìn)行工廠(chǎng)化育苗的快速繁殖提供理論依據(jù)，同時(shí)為大面積開(kāi)發(fā)黑果腺肋花楸優(yōu)良種苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料于2015年10月從遼寧引種栽培在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院園林園藝學(xué)院實(shí)訓(xùn)種植基地。2016年4月，在已經(jīng)萌芽的黑果腺肋花楸植株上選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的枝條供試驗(yàn)用。試驗(yàn)在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院園林園藝學(xué)院組培室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌材料的獲得與消毒 從黑果腺肋花楸所采的枝條上分別取材腋芽、莖段和葉片，切成小段，放入適量水中，然后用自來(lái)水沖洗30 min。將腋芽、葉片、莖段先用75%乙醇漂洗15～30 s，然后用氯化汞溶液對(duì)腋芽、葉片、莖段分別消毒30、15、60～120 s，后用無(wú)菌水沖4～5次，用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分供試用。本試驗(yàn)培養(yǎng)基pH值均調(diào)至 5.8～6.0，高壓滅菌(1 100 Pa，121 ℃)15 min。培養(yǎng)室溫度為(23±2) ℃，光照度為1 500～2 000 lx，光照時(shí)間為 16 h/d。

1.2.2 外植體的誘導(dǎo) 將已消毒的腋芽、莖段(切除兩端，留長(zhǎng)度約為1.5 cm)、葉片(大小切成為0.5～0.8 cm)分別接種到添加不同濃度(1.0、2.0、3.0 mg/L)的6-BA和NAA(0.1、0.2和0.3 mg/L)的MS基本培養(yǎng)基上(表1)，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。每7 d觀(guān)察1次，30 d后分別統(tǒng)計(jì)腋芽、葉片、莖段的誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)情況。

誘導(dǎo)率=出愈外植體個(gè)數(shù)/接種外植體個(gè)數(shù)×100%[13]。

表1 外植體誘導(dǎo)的因素水平

1.2.3 初代愈傷組織的增殖培養(yǎng) 選擇無(wú)污染、長(zhǎng)勢(shì)好的初代愈傷組織，分別接種到添加不同濃度的6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)和NAA(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L)的MS基本培養(yǎng)基中(表2)，每個(gè)處理接種30個(gè)愈傷組織，重復(fù)3次。每4 d觀(guān)察1次，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算愈傷組織分化率，并記錄生長(zhǎng)狀況。

愈傷組織分化率=形成不定芽的愈傷組織數(shù)/總愈傷組織數(shù)×100%[13]

表2 增殖培養(yǎng)的因素水平

1.2.4 組培苗的生根誘導(dǎo) 將長(zhǎng)度約2 cm的植株轉(zhuǎn)接至含有不同濃度的NAA(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/L)和IBA(0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mg/L)的1/2 MS培養(yǎng)基上(表3)進(jìn)行生根培養(yǎng)。30 d后對(duì)生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)和苗生長(zhǎng)情況分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

表3 生根誘導(dǎo)的因素水平

1.2.5 組培苗馴化與移栽 生根培養(yǎng)到19 d時(shí)，選取根系健壯的黑果腺肋花楸無(wú)菌苗進(jìn)行馴化和移栽。首先，將無(wú)菌苗從培養(yǎng)室移至常溫室內(nèi)，去掉封口膜放置3 d，然后取出苗用自來(lái)水沖洗根部附著的培養(yǎng)基，最后將苗移栽到事先準(zhǔn)備好的草炭土和珍珠巖的混合基質(zhì)(V草炭土∶V珍珠巖=1 ∶1)中，浸透水后放置在通風(fēng)良好、濕度較高、光照充足的環(huán)境條件下培養(yǎng)，觀(guān)察記錄幼苗生長(zhǎng)情況，30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel進(jìn)行初步處理后，用DPS(15.10)高級(jí)版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)不同外植體誘導(dǎo)的影響

從表4可以看出，將黑果腺肋花楸的腋芽、莖段和葉片分別接種到添加不同濃度的6-BA和NAA組合的基本培養(yǎng)基中，4 d腋芽左右開(kāi)始萌動(dòng)，莖段和葉片6 d左右開(kāi)始萌動(dòng)。腋芽在A6組合(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)的誘導(dǎo)率最高，達(dá)86.67%，顯著高于其他組合處理；其次是A3組合(6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)，誘導(dǎo)率為71.11%，其顯著高于A8(6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)、A1(6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L)和A9組合(6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)，且A1和A9組合的誘導(dǎo)率最低，為53.33%。莖段誘導(dǎo)率在A5組合(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)中誘導(dǎo)率最高，為67.78%，在A6(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)和A9組合(6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)中誘導(dǎo)率最低，為36.67%。葉片的誘導(dǎo)率在A5(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)和A6(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)組合中較高，達(dá)60.00%以上，顯著高于A1、A3、A4和A9組合的誘導(dǎo)率，最高幅達(dá)66.65%。

在同一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合下，腋芽、葉片和莖段的誘導(dǎo)率基本表現(xiàn)為腋芽最高，其次是葉片，莖段的誘導(dǎo)率最低(表4)。除A1、A2和A5組合外，其他組合均表現(xiàn)出腋芽的誘導(dǎo)率顯著高于葉片或莖段，增幅范圍在11.62%～136.35%之間。

綜上所述，A5(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)和A6組合(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)最適于外植體不定芽的誘導(dǎo)；腋芽、葉片和莖段作為外植體誘導(dǎo)時(shí)，腋芽的誘導(dǎo)率最高達(dá)86.67%，是最理想的材料。

2.2 不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織分化培養(yǎng)的影響

將獲得長(zhǎng)勢(shì)好的初代愈傷組織分別接種到添加不同濃度的6-BA和NAA組合的MS基本培養(yǎng)基中觀(guān)察其增殖生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明，不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)初代愈傷組織增殖分化有一定的促進(jìn)作用。在B7(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L)、B5(6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L)和B8組合(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L)培養(yǎng)基上接種后，4 d就可看到伸長(zhǎng)，并長(zhǎng)出小的葉片，10 d后莖段已長(zhǎng)到1.0 cm，基部產(chǎn)生綠色或淡綠色愈傷組織，并出現(xiàn)許多芽苞，20 d后分化大量小芽，芽深綠色(圖1)；而B(niǎo)14(6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L)和B15組合(6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L)在接種后7 d才看到伸長(zhǎng)，15 d后基部產(chǎn)生淡綠色的愈傷組織，分化極少小芽，芽淺綠色，少量的根。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明愈傷組織的分化主要受細(xì)胞分裂素6-BA與生長(zhǎng)素NAA二者相對(duì)濃度的影響，6-BA和NAA相對(duì)濃度增大時(shí)均有利于愈傷組織的分化和增殖。

表4 不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)不同外植體誘導(dǎo)的影響

注：表中數(shù)據(jù)是3個(gè)重復(fù)的平均值，同列中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，同行中不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。

黑果腺肋花楸的初代愈傷組織分化率存在顯著差異，由表5可看出，B7(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L)的愈傷組織分化率最高，達(dá)83.33%，其次是B5(6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L)、B8(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L)和B6

組合(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)，分化率分別為85.56%、83.33%和78.89%，分化率最低的是B15組合(6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L)，為40.00%。除B5和B8組合外，B7組合的愈傷組織分化率顯著高于其他各處理組合，最高幅達(dá)116.68%。

綜上所述，B7(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L)、B5(6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L)和B8(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L)組合較適宜黑果腺肋花楸愈傷組織增殖分化，其生長(zhǎng)狀況也較好。

表5 不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織增殖分化的影響

注：表中數(shù)據(jù)是3個(gè)重復(fù)的平均值，同列中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)組培苗生根誘導(dǎo)的影響

將經(jīng)分化培養(yǎng)長(zhǎng)到2 cm左右的黑果腺肋花楸組培苗轉(zhuǎn)接至1/2 MS培養(yǎng)基上，并添加入不同濃度的NAA和IBA進(jìn)行生根誘導(dǎo)，試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸無(wú)菌苗較易生根，接種后4 d左右開(kāi)始小苗基部出現(xiàn)根原基突起，逐漸長(zhǎng)出白色新根，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表6)大部分苗生根。生根率在C4培養(yǎng)基(1/2MS+NAA 0.7 mg/L)中最高，達(dá)95.33%，顯著高于其他處理，生根率大于80.00%的從高到低排序?yàn)镃8>C3>C7>C2=C9，其對(duì)應(yīng)數(shù)值分別為91.67%、88.00%、83.00%、82.33%、82.33%，而C10培養(yǎng)基(1/2MS+IBA 0.9 mg/L)的生根率最低，為69.00%，除C2、C7和C9間差異不顯著外，其他各處理間差異顯著。根數(shù)在C4、C8培養(yǎng)基中較多，平均為5.67、5.37條，顯著高于其他各處理培養(yǎng)基，最高幅達(dá)220.34%；C3培養(yǎng)基中的根數(shù)次之，為4.57條，與其他處理間差異顯著；C10培養(yǎng)基中的根數(shù)最少，為1.77條。根長(zhǎng)變化表現(xiàn)出與根數(shù)一樣的趨勢(shì)，在C4、C8培養(yǎng)基中較長(zhǎng)，為3.32、3.13 cm，顯著高于其他各處理培養(yǎng)基，其次是C7>C9>C3；最短根長(zhǎng)在C10培養(yǎng)基中，僅為1.17 cm，顯著低于其他9個(gè)處理。組培苗在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況與生根率、根數(shù)和根長(zhǎng)表現(xiàn)一樣，即C4和C8培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較佳，在C10培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一般。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，C4(1/2MS+NAA 0.7 mg/L)、C8(1/2MS+IBA 0.5 mg/L)和C3(1/2MS+NAA 0.5 mg/L)組合的培養(yǎng)基較適宜黑材料果腺肋花楸組培苗的生根誘導(dǎo)和生長(zhǎng)(圖2)。

2.4 組培苗的馴化與移栽

將黑果腺肋花楸生根苗移栽到草炭土 ∶珍珠巖為1 ∶1的基質(zhì)中，30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率，試驗(yàn)結(jié)果表明，移栽成活率高達(dá)94.78%，且苗的長(zhǎng)勢(shì)較好(圖3)。

3 討論與結(jié)論

植物組培快繁是當(dāng)前大面積種苗繁育的主要方法之一，其具有節(jié)藥材料、縮短苗木生產(chǎn)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)組培快繁可提高黑果腺肋花楸種苗的繁殖系數(shù)，彌補(bǔ)種子繁殖、扦插等傳統(tǒng)育苗方法的不足。已有研究報(bào)道證明，黑果腺肋花楸的離體培養(yǎng)、植株再生是切實(shí)可行的[7]。目前已發(fā)現(xiàn)有利用原生質(zhì)體、胚乳、組培苗瓶外生根以及不定芽誘導(dǎo)與增殖的研究報(bào)道[8-10，12]。本試驗(yàn)選用黑果腺肋花楸的不同外植體為材料，進(jìn)行誘導(dǎo)篩選、增殖、生根、組培苗馴化移栽等一系列再生體系研究，在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合在組織培養(yǎng)過(guò)程中起重要作用，可見(jiàn)培養(yǎng)基中添加外源激素直接影響體細(xì)胞愈傷組織的誘導(dǎo)及分化[14]。

表6 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗生根及生長(zhǎng)狀況的影響

注：*的數(shù)目表示組培苗生長(zhǎng)情況：*表示生長(zhǎng)一般，**表示生長(zhǎng)良好，***表示生長(zhǎng)很好，****表示生長(zhǎng)最佳。

本研究選取黑果腺肋花楸的腋芽、莖段和葉片不同外植體用不同濃度組合的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基組合最適于莖段和葉片的誘導(dǎo)，而MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基最適于腋芽的誘導(dǎo)，這與李冬杰等研究報(bào)道結(jié)果[11]相似。3種外植體中以腋芽的誘導(dǎo)率最高，其次是葉片，莖段的誘導(dǎo)率最低，說(shuō)明本試驗(yàn)中腋芽是最理想的外植體誘導(dǎo)材料。選配適宜的外植體是植物組培快繁的第1步，因?yàn)椴煌庵搀w所處的生理狀態(tài)、分化程度不同，加之外源激素的加入從而表現(xiàn)出不同的再生能力。本試驗(yàn)中低濃度和高濃度的6-BA和NAA均不利于腋芽、莖段和葉片外植體的誘導(dǎo)，可能是過(guò)低濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合沒(méi)有達(dá)到外植體誘導(dǎo)的劑量，而高濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合抑制了黑果腺肋花楸外植體的誘導(dǎo)。

試管苗能否不斷增殖并進(jìn)行繼代培養(yǎng)，是植物組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是組織培養(yǎng)中必不可少的物質(zhì)，不同激素組合對(duì)于腋芽增殖的效果各不相同[15-16]。本試驗(yàn)對(duì)獲得的黑果腺肋花楸初代愈傷組織的增殖分化試驗(yàn)中，最適合組織分化的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L，分化率達(dá)86.67%，且分化大量小芽，芽深綠色，粗壯。說(shuō)明較高濃度(1.0～2.0 mg/L)6-BA與較低濃度(0.4～1.0 mg/L)的NAA組合使用時(shí)效果最佳，這與趙健竹等對(duì)黑果腺肋花楸不定芽誘導(dǎo)與增殖的研究結(jié)果[8]、張春雨等對(duì)黑果腺肋花楸離體葉片愈傷組織誘導(dǎo)及再分化的研究結(jié)果[17]一致。

生根培養(yǎng)是植物組培快繁的第3個(gè)階段，關(guān)系到組培苗能否健壯生長(zhǎng)及后期移栽的成活率。本試驗(yàn)用不同濃度的IBA和NAA對(duì)黑果腺肋花楸組培苗的生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)及生長(zhǎng)狀況等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定觀(guān)察，IBA的濃度在0.3～0.5 mg/L、NAA的濃度在0.5～0.7 mg/L時(shí)生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)結(jié)果表現(xiàn)最優(yōu)，組培苗長(zhǎng)勢(shì)最佳，這與李冬杰等的研究結(jié)果[11]一致。將生長(zhǎng)健壯的組培苗練苗后移栽到草炭土和珍珠巖配比為1 ∶1的基質(zhì)中，成活率高達(dá)94.78%，與高方可等的研究結(jié)果[12，18]一致。

本試驗(yàn)以黑果腺肋花楸的腋芽、莖段和葉片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，然后對(duì)獲得的初代愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)、組培苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)及馴化移栽，成功建立黑果腺肋花楸組織培養(yǎng)快繁再生體系，為其種苗大面積組培快繁、栽培及工廠(chǎng)化育苗提供了一定的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為黑果腺肋花楸的可持續(xù)發(fā)展利用奠定了基礎(chǔ)。