熒光原位雜交技術(shù)在薔薇屬植物研究中的應(yīng)用綜述

田 敏， 張 婷， 唐開(kāi)學(xué)， 張 顥， 邱顯欽， 晏慧君， 王其剛， 蹇洪英

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所/云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650200)

熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是一種非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是將待測(cè)的核酸(DNA或RNA)用連接有報(bào)告分子的核苷酸(如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP)標(biāo)記成探針，然后將標(biāo)記的探針按堿基互補(bǔ)配對(duì)原理雜交到染色體上；檢測(cè)時(shí)用與熒光素耦連的抗報(bào)告分子的單克隆抗體(如anti-digoxigenin-Rhodamine)或特異結(jié)合蛋白(如avidin-FITC)與報(bào)告分子標(biāo)記的核苷酸探針特異性結(jié)合，通過(guò)熒光素的顯色來(lái)確定探針與探針標(biāo)記的靶核酸的共有序列及這些序列在受體細(xì)胞核和染色體上的物理分布，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量研究。FISH技術(shù)具有試驗(yàn)周期短、靈敏度高、分辨率高、直觀可見(jiàn)等優(yōu)點(diǎn)[1]。隨著熒光原位雜交技術(shù)的深入和多元發(fā)展，該方法已用于核酸研究的各個(gè)方面[2]。在植物中，熒光原位雜交技術(shù)主要應(yīng)用于多倍體的起源和演化[3]，植物種間雜交后代的鑒定和外源染色體檢測(cè)[4]，構(gòu)建DNA物理圖譜分析染色體的易位、倒位、互換及重組等結(jié)構(gòu)變異等研究。此外，F(xiàn)ISH在轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞學(xué)鑒定、胚挽救、體細(xì)胞融合植株的早期鑒定、遺傳轉(zhuǎn)化材料分析、基因組的結(jié)構(gòu)及其在細(xì)胞中的空間排列與功能等研究中也發(fā)揮著重要作用，展示了廣闊的應(yīng)用前景。

現(xiàn)代月季為薔薇屬(RosaL.)植物，是世界第一大切花，是由薔薇屬內(nèi)很多種或品種反復(fù)雜交而成的一大類栽培復(fù)合體[5-6]。薔薇屬植物是最先吸引了細(xì)胞學(xué)家注意力的庭園植物之一[7]，從林奈時(shí)期即對(duì)其進(jìn)行了染色體研究[8]。從1904年Strasburger對(duì)薔薇屬染色體基數(shù)的報(bào)道至今，全世界對(duì)其胞核學(xué)的研究已有很多[8-9]，但鑒定薔薇屬的每一條染色體仍很困難。這是因?yàn)槎喾N薔薇屬植物的種子萌發(fā)和枝條扦插較困難，常用嫁接方法進(jìn)行繁殖，植株根系實(shí)為砧木的根系，因此一般選用莖尖為制片材料，而莖尖相對(duì)于根尖細(xì)胞分裂率低、細(xì)胞內(nèi)含物較多、細(xì)胞壁較厚[10]，更為主要的原因是薔薇屬植物的染色體為小染色體(平均長(zhǎng)度 2.81 μm)[11-13]，導(dǎo)致難以穩(wěn)定地得到高質(zhì)量的熒光原位雜交圖譜[14]，使熒光原位雜交技術(shù)在薔薇屬中的應(yīng)用受到一定的限制。此外，由于可利用的薔薇屬染色體特異標(biāo)記有限，利用熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行染色體研究、使每一條染色體有特定的標(biāo)記而便于識(shí)別的工作還無(wú)法展開(kāi)。

筆者綜述了染色體熒光原位雜交技術(shù)在薔薇屬上的應(yīng)用情況，展望了其在該屬植物研究中的應(yīng)用前景，旨在為薔薇屬植物的分子細(xì)胞遺學(xué)研究提供參考。

1 特定DNA序列定位

通過(guò)rDNA在染色體上的定位，能夠清楚地識(shí)別形態(tài)相近的染色體和核型相似的物種。根據(jù)rDNA位點(diǎn)數(shù)目、位置和拷貝數(shù)的變化，可以揭示染色體結(jié)構(gòu)的變異，有利于分析物種親緣關(guān)系、多倍體的形成等問(wèn)題，并將細(xì)胞遺傳學(xué)研究深入到分子水平[1]。薔薇屬中已經(jīng)定位的序列只有高度重復(fù)序列，包括45S rDNA和5S rDNA。

1.1 45S rDNA

45S rDNA在細(xì)胞分裂間期大量轉(zhuǎn)錄表達(dá)形成特殊的區(qū)域，參與核仁形成。每個(gè)45S rDNA轉(zhuǎn)錄單位包括18S rDNA、5.8S rDNA、26S rDNA 3個(gè)亞單位和中間的間隔區(qū)序列(internal transcribe spacer，ITS)，呈高度保守狀態(tài)，在基因組中為串聯(lián)重復(fù)序列，不同物種中的拷貝數(shù)為500～40 000。至今，45S rDNA在25個(gè)薔薇屬野生種/變種、12個(gè)古老月季品種及6個(gè)現(xiàn)代月季品種染色體上的位點(diǎn)數(shù)目和位置已有報(bào)道(表1)。

Ma等于1997年首先將熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用到薔薇屬植物上。她用從大豆(Glycinemax)中克隆到的18-26S rDNA做探針，進(jìn)行了月季花(R.chinensis)、香水月季(R.odorata)、Rosa×fortuniana、金櫻子(R.laevigata)、刺梨(R.roxburgii)和1個(gè)現(xiàn)代品種(Rosa‘Angel Face’)的FISH分析，首次提出用18-26S rDNA重復(fù)序列進(jìn)行薔薇屬植物的染色體熒光原位雜交是可行的，并指出rDNA雜交位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于核仁組織區(qū)(NOR)，具有相對(duì)保守的數(shù)量和位置，即1個(gè)染色體組有1個(gè)NOR，且NOR都位于亞中著絲點(diǎn)染色體的短臂近端部[10]。隨后，F(xiàn)ernández-Romero 等也用來(lái)自大豆的 18-25S rDNA做探針，研究了5個(gè)2倍體薔薇野生種大花香水月季(R.gigantea)、麝香薔薇(R.moschata)、野薔薇(R.multiflora)、玫瑰(R.rugosa)、R.sempervirens和2個(gè)古老品種(R.chinensis‘Semperflorens’，R.gallica‘Versicolor’)的rDNA定位[14]。5個(gè)2倍體薔薇野生種的結(jié)論與Ma等的一致，但古老品種R.chinensis‘Semperflorens’有3個(gè)雜交位點(diǎn)，分布于3條近似的染色體上，而R.gallica‘Versicolor’有6個(gè)雜交位點(diǎn)，位于3對(duì)不同的染色體上。Akasaka等以從小麥(Triticumaestivum)中獲得的45S rDNA做探針，分別對(duì)屬于A型染色體組[21-22]的單瓣月季花(R.chinensisvar.spontanea)、大花香水月季、麝香薔薇、野薔薇、光葉薔薇(R.wichuriana)，B型染色體組的小葉薔薇(R.willmottiae)，C型染色體組的玫瑰和D型染色體組的R.marretii、R.foliolosa進(jìn)行了45 rDNA定位[11-12]，其中A型染色體組的薔薇最為重要，創(chuàng)造現(xiàn)代月季的8個(gè)野生種染色體全部屬于該染色體組[23]。A型染色體組的這5個(gè)薔薇野生種的45S rDNA雜交位點(diǎn)的數(shù)目和位置都比較固定，都有2個(gè)雜交位點(diǎn)，都位于隨體染色體也是最短染色體(chromosome 7)的短臂端部，顯示了在該染色體上的45S rDNA等位基因座。其他3個(gè)染色體組的薔薇野生種的45S rDNA的位置也與A型染色體組的種類近似，位于最短染色體的短臂端部；但R.foliolosa(D型染色體型)的45S rDNA雜交位點(diǎn)數(shù)為6，且與同染色體組的R.marretii核型差異較大。Flory認(rèn)為薔薇屬植物起源于亞洲東部，其中某些種逐漸遷移到北美洲[24]，因此Akasaka等推測(cè)可能在R.foliolosa遷移到北美的過(guò)程中其染色體發(fā)生了重組，形成了因地理分布造成的核型變異[12]。Lim等用從小麥中克隆的 18-5.8-26S rDNA為探針檢測(cè)到5倍體的狗薔薇(R.canina)有5個(gè)45S rDNA雜交位點(diǎn)，但未明確位點(diǎn)的準(zhǔn)確位置[17]。2014年張婷等用來(lái)自番茄(Solanumlycopersicum)的45S rDNA為探針進(jìn)行了桂味組(Section Cinnamomeae)的多苞薔薇(R.multibracteata)、合柱組(Section Synstylae)的川滇薔薇(R.soulieana)及金櫻子組(Section Laevigatae)的金櫻子(R.laevigata)的原位雜交研究，結(jié)果表明45S rDNA的位點(diǎn)數(shù)相對(duì)保守，這3個(gè)2倍體的薔薇品種都只有1對(duì)45S rDNA位點(diǎn)，且大都位于1對(duì)異型同源sm染色體的短臂上，其中多苞薔薇和川滇薔薇的2個(gè)45S rDNA位點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)弱有區(qū)別，而金櫻子的雜交信號(hào)強(qiáng)弱一致[16]。

表1 45S rDNA基因在薔薇屬43個(gè)種或品種染色體上的定位及位點(diǎn)數(shù)目

田敏等分別于2012年和2013年用來(lái)自蕃茄的45S rDNA對(duì)紫月季花(R.chinensisvar.semperflorens)、大白花(R.chinensis‘Dabaihua’)和杏花村(R.chinensis‘Betty Prior’)，香水月季復(fù)合群(R.odoratacomplex)的香水月季原變種(R.odoratavar.odorata)、大花香水月季(R.gigantea)、來(lái)自云南富民的2倍體粉花香水月季(R.odoratavar.erubescens)和來(lái)自云南維西的3倍體粉花香水月季(R.odoratavar.erubescens)[15]，月月紅(R.chinensis‘Slater’s crimson China’)、一品朱衣(R. ‘Yipinzhuyi’ )、牡丹月季(R. ‘Mudanyueji’ )、月月粉(R.chinensis‘Parson’s pink China’)、金粉蓮(R. ‘Jinfenlian’)、 湖中月(R. ‘Huzhongyue’ )、大富貴(R. ‘Dafugui’ )、青蓮學(xué)士(R. ‘Qinglianxueshi’)、春水綠波(R. ‘Chunshuilübo’)、綠萼(R. ‘Viridiflora’)等10個(gè)中國(guó)古老月季品種[18]，以及和平(R. ‘Peace’)、粉和平(R. ‘Pink Peace’)、R. ‘Rose Gaujard’ 、紅雙喜(R. ‘Double Delight’)、蜜糖(R. ‘Honey’)等5個(gè)現(xiàn)代月季品種[19]處于細(xì)胞分裂間期和前中期的核進(jìn)行了熒光原位雜交研究。結(jié)果表明，從月季組的薔薇野生種到中國(guó)古老月季品種的形成過(guò)程中，45S rDNA位點(diǎn)數(shù)與多倍化過(guò)程緊密相關(guān)且與倍性成正比，中國(guó)古老月季的45S rDNA的數(shù)量和位點(diǎn)與原產(chǎn)中國(guó)的野生種一致；但在現(xiàn)代品種中的45S rDNA位點(diǎn)數(shù)減少了，均只有3個(gè)。該研究在一定程度上表明中國(guó)古老月季是由原產(chǎn)中國(guó)的一些野生種經(jīng)長(zhǎng)期的雜交或自然突變，經(jīng)由人工選育固定下來(lái)而形成的，相關(guān)的核型分析[25]和SSR分子標(biāo)記[26]也支持這一觀點(diǎn)；而現(xiàn)代月季滲入了歐洲的一些薔薇屬種質(zhì)，這種遠(yuǎn)緣雜交引起了染色體更大的變異，導(dǎo)致rDNA的數(shù)量發(fā)生較大的變化。此外，原產(chǎn)中國(guó)的月季花復(fù)合群、香水月季復(fù)合群及古老品種，不論是在染色體的倍性和形態(tài)上[25，27]，還是在45S rDNA位點(diǎn)的拷貝數(shù)和間期組織模式上，都表現(xiàn)出多樣性，而現(xiàn)代栽培品種卻表現(xiàn)出一致性。

總體來(lái)說(shuō)，雖然目前對(duì)薔薇屬植物的45 rDNA定位研究主要還是集中在數(shù)量上，對(duì)其在染色體組上的精確定位較少，但從已有的研究可知，除R.foliolosa、古老品種R.gallica‘Vesicolor’和大富貴外，45S rDNA的位點(diǎn)數(shù)在薔薇野生種和古老品種中均對(duì)應(yīng)于核仁組織區(qū)，具有比較保守的數(shù)量和位置，即1個(gè)染色體組對(duì)應(yīng)1個(gè)45S rDNA位點(diǎn)，且都位于亞中部著絲點(diǎn)染色體的短臂近端部?，F(xiàn)代品種的45S rDNA位點(diǎn)數(shù)則表現(xiàn)出與野生種或變種和古老品種不同的變化規(guī)律：除R. ‘Angel Face’外，其他5個(gè)現(xiàn)代品種的45S rDNA少于其對(duì)應(yīng)的染色體組數(shù)，且在拷貝數(shù)和間期組織模式上都表現(xiàn)出一致性，表明反復(fù)的品種間雜交和自交已使染色體結(jié)構(gòu)漸漸趨于同質(zhì)。因此，要進(jìn)一步提高現(xiàn)代月季的品質(zhì)需要從野生資源[28]和古老月季[29]中引入新的種質(zhì)。

1.2 5S rDNA

5S rDNA是絕大多數(shù)生物的核糖體大亞基的一個(gè)組成部分，其功能在真核生物中還不太清楚。5S rDNA基因家族通常以高拷貝串聯(lián)重復(fù)形式存在于基因組中，有2 000～5 000 個(gè)拷貝，且常不與其他重復(fù)序列(如26S-5.8S-18S)串聯(lián)在一起。每個(gè)5S rDNA重復(fù)單位由基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)(間隔區(qū))組成，長(zhǎng)度為200～1 000 bp。編碼區(qū)長(zhǎng)度為 120 bp，非編碼區(qū)長(zhǎng)度為100～700 bp。120 bp的編碼區(qū)相對(duì)間隔區(qū)序列比較保守[30]，間隔區(qū)序列差異很大，位于間隔區(qū)中部的序列變化最豐富[31]。相對(duì)于45S rDNA，5S rDNA應(yīng)用于薔薇屬植物的熒光原位雜交有一定的困難，到目前為止僅對(duì)13個(gè)薔薇野生種進(jìn)行了5S rDNA的定位(表2)。

Ma等首先研究了5S rDNA應(yīng)用于薔薇屬植物染色體熒光原位雜交的可行性。她用克隆自黑木相思樹(shù)(Acaciamelanoxylon)的5S rDNA做探針沒(méi)有獲得成功，但指出來(lái)自黑木相思樹(shù)的5S rDNA既能雜交到與豆科植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的單子葉植物，也能雜交到與之親緣關(guān)系相對(duì)較近的梨屬植物上[10]，此次試驗(yàn)未成功不是由于原位雜交的程序有誤或是5S rDNA序列的差異性，而是由于染色體制片的問(wèn)題。不過(guò)自此后，薔薇屬植物的5S rDNA原位雜交的探針都是克隆自靶染色體材料的基因組本身。

Akasaka等從野薔薇中克隆了5S rDNA，制備成探針對(duì)屬于A型染色體組的單瓣月季花、大花香水月季、麝香薔薇、光葉薔薇，B型染色體組的小葉薔薇，C型染色體組的玫瑰和D型染色體組的R.marretii、R.foliolosa進(jìn)行了rDNA定位[11-12]。A型染色體組的5種薔薇的5S rDNA雜交位點(diǎn)數(shù)目和位置的變化較大，反應(yīng)了染色體重組現(xiàn)象。Wu 等認(rèn)為這5個(gè)種的同源性較高[32-33]，而它們最短染色體上都同時(shí)有45S和5S rDNA位點(diǎn)，這可以作為A型染色體組薔薇的染色體特征標(biāo)記；5S rDNA雜交位點(diǎn)除位于最短染色體以外，其余位點(diǎn)都位于其他染色體長(zhǎng)臂的相近區(qū)域。在B、C、D染色體組的薔薇中，5S rDNA的雜交位點(diǎn)數(shù)目比較固定，位于染色體長(zhǎng)臂上，且與45S rDNA不在同一條染色體上。綜合來(lái)看，這9個(gè)2倍體薔薇中，5S rDNA位點(diǎn)數(shù)有2個(gè)(1對(duì))、3個(gè)和4個(gè)(2對(duì))，其中具1對(duì)5S rDNA位點(diǎn)的種，其5S rDNA位點(diǎn)位于非45S rDNA染色體長(zhǎng)臂的近著絲點(diǎn)處；具3個(gè)或2對(duì)的種有1對(duì)5S rDNA位點(diǎn)與45S rDNA位于同一染色體的長(zhǎng)臂或短臂上，其余位點(diǎn)則位于另外染色體的長(zhǎng)臂的近著絲點(diǎn)處。Lim 等用來(lái)自狗薔薇的5S rDNA為探針與自身的染色體進(jìn)行雜交[17]，得到8個(gè)雜交位點(diǎn)，均位于染色體長(zhǎng)臂的近著絲點(diǎn)處，其中3個(gè)位點(diǎn)與45S rDNA位于同一染色體，另外5個(gè)位點(diǎn)位于別的染色體上。

表2 5S rDNA基因在薔薇屬13個(gè)種染色體上的定位及位點(diǎn)數(shù)目

張婷等參照Akasaka等的方法[11-12]，以PCR方法制備5S rDNA，用于桂味組的多苞薔薇、合柱組的川滇薔薇及金櫻子組的金櫻子的染色體熒光原位雜交研究，得出3個(gè)2倍體野生種的5S rDNA位點(diǎn)數(shù)量不等，但都位于染色體長(zhǎng)臂的近著絲點(diǎn)處，雜交信號(hào)的強(qiáng)弱有差異[16]。具體來(lái)看，多苞薔薇的1對(duì)5S rDNA位于非45S rDNA染色體的長(zhǎng)臂的近著絲點(diǎn)處；川滇薔薇和金櫻子有2對(duì)5S rDNA位點(diǎn)，其中1對(duì)位于45S rDNA染色體的長(zhǎng)臂的近著絲點(diǎn)處，另1對(duì)位于其他染色體長(zhǎng)臂的近著絲點(diǎn)處。由此得出，薔薇屬植物中5S rDNA位點(diǎn)按是否與45S rDNA有共線性分為2種：只有1對(duì)5S rDNA位點(diǎn)，與45S rDNA沒(méi)有共線性，且位于染色體長(zhǎng)臂的近著絲點(diǎn)處；有3個(gè)、2對(duì)或更多5S rDNA位點(diǎn)，與45S rDNA共線性的5S rDNA位點(diǎn)位于染色體短臂或長(zhǎng)臂的近著絲點(diǎn)處，其余位點(diǎn)位于其他染色體長(zhǎng)臂的近著絲點(diǎn)處。該結(jié)論與Akasaka等的[11-12]基本一致。

因此，不同于45S rDNA，5S rDNA的位點(diǎn)數(shù)在薔薇屬不同種中變異較大，有2、3、4、8個(gè)不等，且沒(méi)有一定的規(guī)律，在染色體上也沒(méi)有固定的分布模式。目前尚未見(jiàn)有對(duì)薔薇屬古老品種和現(xiàn)代品種的5S rDNA定位的報(bào)道。

2 染色體同源性分析

熒光原位雜交方法已在很多植物中普遍應(yīng)用，但由于薔薇屬植物的染色體較小，熒光原位雜交技術(shù)的普遍應(yīng)用有一定難度，因此，應(yīng)用其進(jìn)行分子細(xì)胞遺傳學(xué)的深入研究較少，目前主要應(yīng)用于染色體的同源性及親緣關(guān)系的初步推測(cè)上。

在Ma等的研究中，R.×fortuniana分裂間期時(shí)2個(gè)NOR位點(diǎn)在大小上是相同的，但其中1個(gè)NOR位點(diǎn)較分散也較活躍[10]，這與Shepherd認(rèn)為這個(gè)種為雜交起源(R.banksiae×R.laevigata)[34]的觀點(diǎn)相吻合，因此推測(cè)其為雜種起源。同時(shí)，現(xiàn)代品種R. ‘Angel Face’(2n=4x)的染色體組有4個(gè) 18-26S rDNA 雜交位點(diǎn)，但其中2個(gè)位點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)，表明其由AABB 2種異源染色體組成，且比例為2 ∶2。

Fernández-Romero等用18-25S rDNA的原位雜交結(jié)合小孢子母細(xì)胞(pollen mother cells，PMCs)減數(shù)分裂染色體制片、花粉育性觀察和實(shí)際結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)的方法，分析了古老品種R.chinensis‘Semperflorens’和R.gallica‘Versicolor’各自的染色體同源性[14]。R.chinensis‘Semperflorens’的3個(gè)18-25S rDNA雜交位點(diǎn)分布于3條近似的染色體上；PMCs減數(shù)分裂時(shí)最多形成6個(gè)3價(jià)體和3個(gè)1價(jià)體，這兩方面的證據(jù)表明R.chinensis‘semperflorens’的染色體之間具有很高的同源性，為自發(fā)形成的同源3倍體，這種同源性會(huì)導(dǎo)致在減Ⅰ后期時(shí)染色體分配出現(xiàn)較多的錯(cuò)誤從而導(dǎo)致不育；花粉育性觀察和結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)支持此結(jié)論。而R.gallica‘Versicolor’的6個(gè)18-25S rDNA雜交位點(diǎn)位于3對(duì)不同的染色體上，其中位于1對(duì)較小的染色體上的信號(hào)較強(qiáng)，結(jié)合nrDNA的ITS1序列研究的結(jié)果[35]，表明R.gallica‘Versicolor’為異源起源，其中一個(gè)染色體組含有1個(gè)NOR，另一個(gè)染色體組含有2個(gè)NOR。PMCs減數(shù)分裂時(shí)最多形成14個(gè)2價(jià)體，也證明其異源性，在減Ⅰ后期時(shí)染色體能正常分配使其可育；花粉育性觀察和結(jié)實(shí)率數(shù)據(jù)符合此結(jié)論。

狗薔薇為5倍體，它減數(shù)分裂時(shí)特殊的配子不均等分裂方式很早引起了學(xué)者的極大興趣[8，21]。Lim等用FISH技術(shù)輔助分析狗薔薇不均等減數(shù)分裂中的染色體分配情況。他用18-5.8-26S rDNA和5S rDNA為探針，分別與體細(xì)胞和PMCs進(jìn)行雙色FISH，證明了狗薔薇中只有1對(duì)同源染色體，在形成配子時(shí)此同源染色體均勻分配到雌雄配子中，其他一直處于單價(jià)體形式的染色體都分配到雌配子中[17]。該研究為利用FISH深入研究薔薇屬植物的染色體同源性及其配子形成時(shí)的分配方式提供了參考。

張婷等基于rDNA-FISH的核型分析研究發(fā)現(xiàn)多苞薔薇有2種核型類型[16]，一種與Jian等常規(guī)核型分析的結(jié)果相同，屬較為原始的1A型，另一種為更進(jìn)化的2A型[37]。前者沒(méi)有異型同源染色體，且5S rDNA位點(diǎn)染色體不是sm染色體；后者的2對(duì)rDNA染色體都是異型同源染色體。這可能是由于研究材料來(lái)自不同居群，它們之間存在核型差異，這也從細(xì)胞水平上反映了其種內(nèi)存在豐富的形態(tài)變異和遺傳多樣性。川滇薔薇的核型及核型公式與Jian等基于常規(guī)核型分析的結(jié)果[36]相同，但2對(duì)sm染色體的序號(hào)相差較大，這一方面可能是由于研究材料來(lái)源不同所致，另一方面也可能是由于常規(guī)核型分析的精確度不高導(dǎo)致染色體排序有誤。金櫻子在核型和核型公式上與Crane等基于常規(guī)核型分析的結(jié)果相同[37]，但在染色體排序上稍有差別。這3種薔薇野生種均存在異型同源染色體，異型同源染色體由于較大的長(zhǎng)度差異使研究人員在常規(guī)染色體核型分析時(shí)很容易將其錯(cuò)配。因此，基于rDNA-FISH的薔薇屬植物染色體核型分析更加準(zhǔn)確可靠，應(yīng)采用類似的較精確的方法對(duì)一些分布較廣、種內(nèi)存在豐富形態(tài)變異的薔薇進(jìn)行進(jìn)一步的核型研究。由此可見(jiàn)，熒光原位雜交技術(shù)不僅能準(zhǔn)確地識(shí)別各自染色體組中的同源染色體，而且還能通過(guò)雜交位點(diǎn)數(shù)量、位置和強(qiáng)弱體現(xiàn)各自染色體的結(jié)構(gòu)特征，為染色體識(shí)別提供了明確有效的標(biāo)記。

3 原位雜交技術(shù)在薔薇屬植物研究中的應(yīng)用前景

作為分子遺傳學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，原位雜交具有上述2個(gè)學(xué)科所不具備的許多優(yōu)點(diǎn)，它不僅能夠?qū)⒑怂嵝蛄兄苯佣ㄎ辉谌旧w或間期核中的特定位置，以構(gòu)建染色體的物理圖譜，分析染色體和基因組的結(jié)構(gòu)，而且能對(duì)伴隨物種形成過(guò)程中的基因組內(nèi)及基因組間的結(jié)構(gòu)重排進(jìn)行探測(cè)[38]。在其他栽培作物中，利用特定DNA序列、大片段克隆(BAC/YAC)和整個(gè)基因組DNA(gDNA)作為探針，研究多倍體的起源、不同基因組之間的關(guān)系、DNA物理圖譜、染色體結(jié)構(gòu)變異等的報(bào)道已有很多，但在薔薇屬植物的染色體結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)、基因定位、外源染色體鑒定及親緣關(guān)系研究上，F(xiàn)ISH技術(shù)都還沒(méi)有得到充分應(yīng)用。薔薇屬植物分布廣泛、種類眾多、分類復(fù)雜，如何應(yīng)用成熟的FISH技術(shù)來(lái)解決復(fù)雜的遺傳和進(jìn)化問(wèn)題，也就成為了薔薇屬植物分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究的方向。針對(duì)目前的研究現(xiàn)狀，可將FISH應(yīng)用于以下3個(gè)方面。

3.1 現(xiàn)代月季形成過(guò)程中的染色體變異

作物馴化可以看作是植物進(jìn)化的一種模型，在馴化過(guò)程中隨著農(nóng)業(yè)需求性狀的選擇育種，染色體、DNA結(jié)構(gòu)會(huì)隨之改變[39]。薔薇屬植物有著悠久的栽培歷史，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然和人工栽培的變異、雜交、選擇，經(jīng)歷了從薔薇野生種(wild roses or species roses，WR or SR)演化到古老月季(old garden roses，OGR)，進(jìn)而到現(xiàn)代月季(modern roses，MR)的過(guò)程。我國(guó)的薔薇屬資源是創(chuàng)造現(xiàn)代月季的重要原始親本。原產(chǎn)我國(guó)的月季花復(fù)合群(R.chinensiscomplex)和香水月季復(fù)合群(R.odoratacomplex)是現(xiàn)代月季最重要的兩大性狀即連續(xù)開(kāi)花和芳香怡人(茶香)的來(lái)源[23]。我國(guó)古老月季如月月紅、月月粉、彩暈香水和淡黃香水等，對(duì)現(xiàn)代月季的育成起到了決定性的作用[40]，是野生薔薇和現(xiàn)代品種之間的過(guò)渡類型[6，41]。現(xiàn)代月季來(lái)自我國(guó)的原始野生親本均是2倍體[34，42]，而現(xiàn)代月季品種通常是4倍體[43]；Heinisch等還推測(cè)在現(xiàn)代月季的雜交育種中出現(xiàn)過(guò)更高倍(大于4倍)的雜種[44]。那么在從薔薇野生種演化到古老月季，進(jìn)而演化到現(xiàn)代月季的過(guò)程中，染色體在結(jié)構(gòu)上發(fā)生了怎樣的變化？對(duì)現(xiàn)代月季及其重要?dú)v史親本進(jìn)行系統(tǒng)的以染色體熒光原位雜交為基礎(chǔ)的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究，是回答這些問(wèn)題的前提和必要途徑。

3.2 薔薇屬植物的染色體變異及分布規(guī)律研究

薔薇屬約有200多個(gè)種[5]，由于缺乏遺傳背景的詳盡研究，制約了其在現(xiàn)代月季遺傳改良中的深入應(yīng)用。早期的研究認(rèn)為自然界中野生種存在2x至8x的倍性[21-22]，最近在分布于我國(guó)云南的野生種中發(fā)現(xiàn)了6x和10x[36，45]卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)4x和8x，并且多倍化主要集中在分布于高海拔地區(qū)的桂味組植物中，總體比例不到10%。根據(jù)已有的關(guān)于薔薇屬植物的染色體報(bào)道可知，除分布在歐洲的狗薔薇組(Sect.Caninae)和薔薇組(Sect.Rosa)、高海拔和極地周圍的桂味組以及北美的卡羅萊納組(Sect.Carolinae)中多倍體種占一定比例外，絕大部分薔薇野生種均為2倍體。因此，薔薇屬植物進(jìn)化和演化的細(xì)胞學(xué)動(dòng)力主要還是來(lái)自染色體的重組和結(jié)構(gòu)變異。那么，薔薇屬植物是否存在比10x更高的倍性？組間和組內(nèi)各種間基于FISH的親緣關(guān)系如何？多倍體和染色體結(jié)構(gòu)變異與生境特別是海拔的關(guān)系如何？系統(tǒng)演化過(guò)程中染色體重組和結(jié)構(gòu)變異各自扮演了怎樣的角色？利用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行深入研究，是研究薔薇屬植物的遺傳多樣性和系統(tǒng)演化的必要細(xì)胞學(xué)手段，也可為利用這些野生資源對(duì)現(xiàn)代月季品種進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和遺傳改良提供細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)。

3.3 薔薇屬植物多倍體的起源研究

植物多倍化是一種普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象，多倍化是植物進(jìn)化和多樣化的重要原動(dòng)力[46-47]。對(duì)于植物多倍體，F(xiàn)ISH和GISH(基因組熒光原位雜交技術(shù))是探測(cè)祖先基因組來(lái)源、理清種間進(jìn)化關(guān)系、構(gòu)建遺傳圖譜、分析基因組雜交漸滲和促進(jìn)遺傳育種的重要手段[48]。常用的方法有單親本GISH[49]、雙親本GISH[50]、基因組特異探針[51]并結(jié)合減數(shù)分裂時(shí)染色體的配對(duì)行為[14]等方法來(lái)判斷多倍體基因組的起源和組成，特別是GISH為鑒別外源染色體帶來(lái)了方法上的革命[52]。雖然整個(gè)薔薇屬植物系統(tǒng)演化的主要細(xì)胞學(xué)動(dòng)力可能不是多倍化，但多倍化現(xiàn)象在狗薔薇組、桂味組及卡羅萊納組中卻十分顯著。那么，這些多倍體是如何形成的？是多倍化(同源多倍化和異源多倍化)還是由原始染色體斷裂產(chǎn)生？哪些種參與了它的形成并承擔(dān)了什么角色？要解答這些科學(xué)問(wèn)題，需要用到分子細(xì)胞遺傳學(xué)的研究方法，可以利用與多倍體薔薇有較近親緣關(guān)系且分布區(qū)重疊的其他薔薇的基因組為探針進(jìn)行GISH雜交，并結(jié)合減數(shù)分裂時(shí)染色體rDNA-FISH信號(hào)進(jìn)行分析，闡明這些多倍體薔薇的起源和形成過(guò)程，為研究薔薇屬植物的系統(tǒng)演化提供分子細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)。