大鼠下腔靜脈型巴德-吉亞利綜合征動物模型的制備

方偉偉，成德雷，呂維富*，朱 楠，陳曉明，劉開才

(1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院影像科，安徽 合肥 230001；2.安徽省五河縣人民醫(yī)院影像科，安徽 蚌埠 233300；3.安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院消化科，安徽 合肥 230601)

巴德-吉亞利綜合征(Budd-Chiari syndrome, BCS)是肝靜脈(hepatic vein, HV)和/或其開口以上的下腔靜脈(inferior vena cava, IVC)阻塞，導致門靜脈(portal vein, PV)和/或IVC高壓的臨床癥候群[1]，根據(jù)阻塞部位可分為HV阻塞型、IVC阻塞型和混合型[2]，西方國家以HV阻塞型BCS較常見，而亞洲國家則以IVC阻塞型為主[3-4]。目前有關BCS的相關基礎研究及動物模型造模研究相對較少[5-7]。本研究通過部分結扎大鼠肝后段IVC建立IVC阻塞型BCS模型，旨在為BCS研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1實驗對象 健康成年雄性SD大鼠36只[購于安徽省立醫(yī)院實驗動物中心，許可證號：SCXK(蘇)2005-0001]，體質(zhì)量185～235 g。普通飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫15℃～25℃，濕度50%～60%，保持飼養(yǎng)室良好通風及潔凈。采用隨機數(shù)字法將其均分為模型組和對照組，每組18只。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學動物倫理委員會批準。

1.2模型制備 術前實驗鼠停飼1日(不停水)。以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉動物，腹部備皮后保定于實驗臺，常規(guī)消毒、鋪巾。取劍突下腹部正中切口，逐層進腹后分離鐮狀韌帶，下壓肝臟暴露肝后段IVC，游離IVC，將3F微導管(泰爾茂)平行緊貼IVC，并以0號線環(huán)繞扎緊后抽出微導管，關腹前給予青霉素每只20 U腹腔灌洗，再逐層縫合，術后連續(xù)5天肌肉注射青霉素每只20 U。對照組暴露而不結扎IVC，其余步驟同模型組。術前和術后處死前每日稱取大鼠體質(zhì)量。

1.3肝功能指標檢測 于術后第28天以眼眶后靜脈叢采血法取1～2 ml靜脈血，檢測肝功能指標，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(glutamyltransferase, GGT)、白蛋白(albumin, ALB)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL)及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)。

1.4影像學檢查

1.4.1超聲檢查 術后第84天，停飼8 h后對大鼠進行腹部超聲檢查，記錄肝臟和脾臟大小、形態(tài)、內(nèi)部回聲，觀察HV、PV和IVC是否通暢、有無狹窄、有無肝內(nèi)和/或肝外側支形成。

1.4.2DSA檢查 術后第85天，暴露大鼠任意一側下肢股靜脈，置入21G留置針，行DSA，觀察IVC阻塞段及側支靜脈形成情況。

1.5病理檢查 DSA后第2天，采用上述同樣方法麻醉大鼠，開腹取大鼠肝臟、脾臟樣本，采用游標卡尺測量脾臟長徑、寬度及厚度，并用電子分析天平(Mettler Toledo PL403)稱重。取肝左葉約1 mm×1 mm×1 mm組織塊固定于2.5%戊二酸磷酸鹽緩沖液，以透射電鏡(JEM-1230型)觀察肝細胞的細胞膜、細胞核、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體等結構。取適量肝臟及脾臟固定于4%甲醛溶液，經(jīng)石蠟包埋、切片，行常規(guī)HE染色，光學顯微鏡(Nikon 80i)觀察肝臟、脾臟形態(tài)學改變。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示。采用獨立樣本t檢驗或t'檢驗比較2組大鼠體質(zhì)量、脾臟質(zhì)量，以及脾臟長徑、寬度、厚度和肝功能指標；對2組組內(nèi)術前和術后第7天、第21天大鼠體質(zhì)量進行方差齊性檢驗，采用重復測量設計資料的方差分析進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1建模情況 模型組大鼠術中死亡1只，術后分別于第7天及第11天因感染死亡2只，余15只成功建模，建模成功率83.33%(15/18)。模型組大鼠生長緩慢，毛色灰暗無光澤；術后第3天9只出現(xiàn)對疼痛反應減低；術后第4天均出現(xiàn)活動減少、食欲減退、對外界刺激反應遲緩；術后第12～21天均出現(xiàn)體質(zhì)量增加，

表1 模型組與對照組大鼠不同時間點的體質(zhì)量比較(g，±s，n=15)

表1 模型組與對照組大鼠不同時間點的體質(zhì)量比較(g，±s，n=15)

組別術前術后第7天術后第21天處死時模型組206.56±15.56207.73±15.54226.93±15.79290.40±28.88對照組209.11±11.49212.27±12.71215.93±13.30333.13±14.61t值0.830.764.2626.15P值0.580.390.048<0.01

圖1 大鼠腹部超聲 A.對照組大鼠肝臟體積不大，肝內(nèi)回聲均勻，肝周未見液性暗區(qū)，IVC未見明顯狹窄; B.模型組大鼠脾臟周圍可見液性暗區(qū)(箭)，脾臟腫大; C.箭示狹窄端IVC; D.肝內(nèi)靜脈形成交通支，血流豐富 (liver:肝臟;spleen:脾臟;IVC：下腔靜脈)

腹部膨隆、腹壁緊張，于術后第15天隨機抽取其中6只行腹腔穿刺，可抽出淡黃色液體；術后第28天開始大鼠腹部膨隆、腹壁緊張緩解，體質(zhì)量降低。術后第86天處死時，大鼠腹腔內(nèi)均可見淡黃色積液，3只可見明顯胃腸道淤血、脹氣擴張，7只可見腹壁淺靜脈及腹腔側壁靜脈紆曲增粗。

對照組大鼠術中死亡1只，術后第6天死于感染1只，術后第10天不明原因死亡1只，余15只存活，死亡率16.67%(3/18)。15只大鼠術后前3天均對疼痛反應減低，后活動如常、飲食正常，反應機警，體質(zhì)量呈逐漸增加趨勢，未出現(xiàn)BCS相關癥狀。

2.2體質(zhì)量變化 2組組內(nèi)不同時間點大鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；2組術前、術后第7天大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義，術后第21天模型組大鼠體質(zhì)量高于對照組，處死時對照組大鼠體質(zhì)量高于模型組，見表1。

2.3肝功能情況 術后第28天，模型組大鼠ALT、AST、ALP、GGT、TBIL較對照組升高(P均<0.05)；而DBIL和ALB差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見表2。

2.4超聲表現(xiàn) 模型組：肝、脾腫大，肝臟實質(zhì)回聲增粗，肝、脾周圍和腸間隙可見明顯液性暗區(qū)；肝內(nèi)靜脈淤血擴張并可見豐富肝內(nèi)交通支；IVC阻塞，遠端管腔不同程度擴張；12只結扎處IVC變窄，余3只結扎處IVC完全閉塞；IVC內(nèi)有高回聲血栓形成，血流充盈缺損，嚴重者腔內(nèi)未見血流充盈；IVC周圍可見新的側支血管。對照組：肝、脾不大，內(nèi)部回聲均勻，腹腔未見液性暗區(qū)；肝內(nèi)靜脈無明顯擴張、無交通支，IVC未見狹窄或擴張，血流通暢。見圖1。

2.5DSA表現(xiàn) 模型組：IVC結扎處管腔明顯變窄，狹窄段管徑均<0.8 mm(狹窄率>80%)，對比劑線性通過，其遠端管腔擴張，并可見腰升靜脈開放，IVC血流通過側支循環(huán)匯入上腔靜脈，同時胸腹腔內(nèi)側壁曲張靜脈可顯影。對照組：IVC未見明顯狹窄，回心血流通暢。見圖2。

2.6病理學表現(xiàn) 大體病理：模型組大鼠肝臟呈暗紫色，以肝臟邊緣較為明顯，肝臟淤血腫大，被膜緊張，表面呈粟粒樣改變，觸之質(zhì)韌，其中6只大鼠肝臟與膈肌粘連；對照組肝臟呈暗紅色，表面光滑，質(zhì)地柔軟，其中3只大鼠肝臟與膈肌粘連。模型組和對照組脾臟長徑分別為(36.80±2.90)mm和(30.60±1.96)mm(t=5.61，P<0.01)，寬度分別為(7.00±0.76)mm和(6.47±0.91)mm(t=1.74，P=0.93)，厚度分別為(3.93±0.70)mm和(3.73±0.80)mm(t=0.73，P=0.47)，脾臟質(zhì)量分別為(0.68±0.10)g和 (0.37±0.27)g(t=9.15，P<0.01)。

表2 模型組與對照組大鼠術后第28天時肝功能情況(±s，n=15)

表2 模型組與對照組大鼠術后第28天時肝功能情況(±s，n=15)

組別ALT(U/L)AST(U/L)GGT(U/L)ALB(g/L)TBIL(μmol/L)DBIL(μmol/L)ALP(U/L)模型組112.58±14.96287.00±34.361.80±0.4734.48±3.512.45±0.351.59±0.63234.83±64.76對照組41.47±5.49130.40±19.091.25±0.4033.15±2.021.17±0.521.25±0.7163.93±18.00t值17.0915.033.311.237.321.299.80P值<0.01<0.010.030.23<0.010.21<0.01

圖2 DSA表現(xiàn) A.對照組，箭示大鼠膈下IVC，管腔未見明顯狹窄及擴張; B.模型組，黑箭示膈下IVC明顯狹窄，狹窄段管腔直徑約0.8 mm，白箭示腰升靜脈開放并匯入上腔靜脈 圖3 模型組病理圖 A.肝細胞排列紊亂，正常肝細胞索消失，肝小葉中央靜脈及其周圍肝血竇擴張，其內(nèi)可見大量紅細胞淤積(HE，×200); B.肝小葉中央靜脈周圍肝細胞廣泛脂肪樣變性(HE，×400)

光鏡下見模型組肝細胞索紊亂，肝細胞腫脹、脂肪樣變性；較嚴重區(qū)域肝小葉結構消失，肝細胞壞死，炎性細胞浸潤，中央靜脈及肝血竇擴張、淤血，匯管區(qū)纖維增生和輕度纖維化，尚無纖維間隔包繞形成假小葉(圖3)；脾臟見脾竇輕度擴張，竇內(nèi)皮細胞增生，脾小體萎縮；對照組肝細胞呈多面形，細胞核大而圓，核仁清晰；胞質(zhì)豐富、呈粉紅色；肝細胞相互連接成肝細胞索；脾臟未見異常。

透射電鏡見模型組肝細胞局限性水腫，肝細胞內(nèi)細胞器減少，線粒體嵴斷裂或空泡變性，肝細胞胞質(zhì)內(nèi)大量脂滴堆積，粗面及光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，周圍線粒體減少，肝細胞核膜裂隙增寬；對照組大鼠肝細胞形態(tài)正常，內(nèi)有豐富的線粒體、高爾基體，核膜清晰。

3 討論

IVC阻塞型是亞洲國家最常見的BCS分型。既往汪海軍等[6]采用外科手術縮窄家兔HV主干制備BCS動物模型；王春喜等[8]利用介入技術制備HV阻塞型BCS動物模型，對設備、技術要求高，成本亦高，不能高度模擬IVC阻塞型，且選擇性阻塞HV可導致相應肝葉缺血壞死、萎縮，其余肝葉代償性增大，不能很好地模擬BCS的自然病程發(fā)展過程。

本研究借鑒Akiyoshi等[9]的方法制備IVC阻塞型BCS，建模成功率83.33%。術中選用3F微導管代替玻璃棒，可避免完全結扎IVC造成的急性肝功能衰竭，且微導管柔順性較好，還可避免術中造成氣胸或肝臟損傷。此法制備IVC阻塞型BCS模型成本低，所需器械、試劑及藥品易于獲得；大鼠為常用實驗動物，易獲得、造價低，且易飼養(yǎng)，管理方便；其肝臟解剖結構與人類相似度較高，動物模型模擬性強；術中操作簡單，便于推廣及大批量造模，所獲模型可高度模擬我國多發(fā)型BCS疾病類型。

建模后第12天始，模型組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，腹部穿刺抽出淡黃色液體，提示腹腔積液形成：PV壓力升高時，腹腔內(nèi)臟血管床靜水壓升高，組織液回收減少而漏入腹腔，從而形成腹腔積液。建模后第28天始模型組大鼠腹腔積液逐漸減少，與肝內(nèi)交通支及周圍側支靜脈形成有關：腹部超聲證實肝內(nèi)靜脈出現(xiàn)廣泛交通支，下腔靜脈DSA發(fā)現(xiàn)腰升靜脈開放，病理見腹壁及腹腔內(nèi)側壁淺靜脈縱行紆曲、擴張，與BCS患者腹部靜脈曲張形成原因類似，均為IVC阻塞后導致IVC高壓癥候群。建模后模型組大鼠食欲減低，與胃腸道血流回心受阻、胃腸道淤血有關。出現(xiàn)大量腹腔積液時，上述癥狀加重，導致模型組大鼠生長緩慢。

術后第28天，模型組大鼠ALT、AST、ALP、GGT及TBIL較對照組升高，提示長期肝臟淤血造成肝細胞損傷，肝、脾大體標本及電鏡觀察均可見相關表現(xiàn)。部分結扎IVC后，HV回心血流受阻，淤血從肝小葉中心靜脈開始一直擴展到肝血竇，長期肝臟血流回流不暢可致肝內(nèi)PV、HV和肝動脈血液循環(huán)失衡，造成肝細胞缺氧和養(yǎng)料供給障礙，進而發(fā)生非炎性壞死，炎性細胞浸潤，匯管區(qū)纖維增生并形成纖維分隔。

我國多數(shù)BCS患者主要以腹腔積液、胸腹壁靜脈曲張和肝脾腫大等癥狀就診[10]。本研究所制動物模型均存在腹腔積液、胸腹壁靜脈曲張和肝脾腫大等PV及IVC高壓癥候群，與BCS臨床表現(xiàn)相似；影像學檢查顯示大鼠IVC及HV血液回流受阻，IVC管徑狹窄甚至閉塞，同時見側支循環(huán)開放，與臨床IVC阻塞型BCS相類[11]。

綜上所述，部分結扎大鼠肝后段IVC所建立的IVC阻塞型BCS動物模型可較好地模擬IVC阻塞型BCS患者的臨床表現(xiàn)及病理生理改變。