羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系分析*

劉志剛 盧邁新 曹建萌 高風(fēng)英

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羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系分析*

劉志剛 盧邁新①曹建萌 高風(fēng)英

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510380)

羅非魚“粵閩1號”是用尼羅羅非魚()和奧利亞羅非魚()培育的全雄羅非魚新品種。采用同工酶電泳技術(shù)和線粒體DNA控制區(qū)序列分析方法，對羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及群體之間的遺傳關(guān)系進(jìn)行研究。同工酶電泳結(jié)果顯示，酯酶(EST)和乳酸脫氫酶(LDH)的酶譜具有組織和群體特異性。肌肉和脾臟中的EST表達(dá)量極低，而肝臟中的EST表達(dá)量較高，LDH在3種組織中均有較高表達(dá)，但酶譜存在差異。在羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體中，共檢測到10條EST酶帶和5條LDH酶帶，多態(tài)性位點(diǎn)比例()為12.50%~71.43%，平均觀測雜合度(o)為0.0417~0.6143，Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)()為?0.2347~0.9072。線粒體DNA控制區(qū)序列分析結(jié)果顯示，mtDNA D-loop區(qū)的堿基組成無顯著差異，均呈現(xiàn)出A+T堿基偏向性(63.39%)。在羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體中，共發(fā)現(xiàn)20種單倍型，核苷酸多樣性指數(shù)(P)為0~0.0519，奧尼羅非魚雌魚(WY1)、尼羅羅非魚雌魚(XX)、尼羅羅非魚雄魚(XY)和羅非魚“粵閩1號”(XY2)群體的P值(0.0440~0.0519)明顯高于超雄尼羅羅非魚(YY1)、超雄奧尼羅非魚(YY2)和奧利亞羅非魚雌魚(WZ)群體的P值(0~0.0009)。各群體之間的遺傳分化指數(shù)(ST)為?0.0115~0.9963，XY2與WY1群體之間、XX與XY群體之間以及WZ和YY2群體之間的遺傳分化不顯著(ST<0.05,>0.05)。XY2群體與尼羅羅非魚群體(XX群體和XY群體)和奧利亞羅非魚群體(WZ群體)之間的平均遺傳距離分別為0.0639和0.0695。在NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹中，XX、XY、YY1和XY2群體聚為一支，WY1、WZ和YY2群體聚為另一支。本研究揭示了羅非魚“粵閩1號”的生化和分子遺傳特征，為其種質(zhì)鑒定、繁育群體的構(gòu)建和優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳提供理論基礎(chǔ)。

羅非魚“粵閩1號”；同工酶；線粒體DNA控制區(qū)；遺傳多樣性；遺傳關(guān)系

羅非魚“粵閩1號”為本研究團(tuán)隊(duì)與福建百匯盛源水產(chǎn)種業(yè)有限公司和西雙版納同益水產(chǎn)科技有限公司在漳州市和西雙版納育種基地歷經(jīng)7年(2010~ 2016年)培育出來的全雄羅非魚新品種，該羅非魚新品種以尼羅羅非魚()和奧利亞羅非魚()為基礎(chǔ)群體，通過群體選育、家系選育、雜交育種和遺傳全雄羅非魚(Genetic male tilapia,)技術(shù)等復(fù)合育種技術(shù)培育而成，其培育技術(shù)路線見圖1。近年來，羅非魚“粵閩1號”分別在云南、廣東、福建、廣西和海南等省進(jìn)行了池塘、網(wǎng)箱和水庫中試養(yǎng)殖，結(jié)果顯示，其具有雄性率高、生長快、抗病力強(qiáng)、出肉率高和飼料轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)。為了揭示其種質(zhì)特征，有必要對羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系進(jìn)行研究。

圖1 羅非魚“粵閩1號”的培育技術(shù)路線

同工酶在生物界廣泛存在，變異豐富，呈共顯性遺傳，由1個(gè)或多個(gè)基因座位編碼，能比較客觀地代表基因組的變異，可揭示生物種群的進(jìn)化和親緣關(guān)系，是一種生化表現(xiàn)型的遺傳標(biāo)志，且有實(shí)驗(yàn)條件簡單、成本低、結(jié)果快速可靠等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)物種鑒定、種間親緣關(guān)系和遺傳進(jìn)化分析(楊淞等, 2006; 張健東等, 2015; 丁金強(qiáng)等, 2013)。線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)是細(xì)胞核外具有自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力的環(huán)狀雙螺旋DNA，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、高度多態(tài)、母性遺傳等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于魚類種群的進(jìn)化和遺傳研究(Teletchea, 2009; 胡玉婷等, 2015)。mtDNA D-loop區(qū)是線粒體基因組中變異最大、進(jìn)化速度最快的區(qū)域，具有較高的突變積累，適用于種內(nèi)、種群或個(gè)體間遺傳多樣性的研究，也可用于種間遺傳差異分析(吳長敬等, 2010; 頡曉勇等, 2014; 劉紅等, 2016)。

本研究采用同工酶電泳技術(shù)和mtDNA控制區(qū)測序分析方法，對羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體進(jìn)行遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系分析，從而揭示羅非魚“粵閩1號”的生化和分子遺傳特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體共7個(gè)羅非魚群體的樣品均采集于本研究團(tuán)隊(duì)與福建百匯盛源水產(chǎn)種業(yè)有限公司和西雙版納同益水產(chǎn)科技有限公司在漳州市和西雙版納的育種基地。尼羅羅非魚雌魚(XX)、尼羅羅非魚雄魚(XY)、奧利亞羅非魚雌魚(WZ)為以生長速度為群體選育指標(biāo)的F5代，超雄尼羅羅非魚(YY1)為F4代尼羅羅非魚雄魚(XY)與尼羅羅非魚偽雌魚(P-XY)交配后，通過性別標(biāo)記篩選獲得的群體。奧尼羅非魚雌魚(WY1)為超雄尼羅羅非魚(YY1)與F5代奧利亞羅非魚雌魚(WZ)雜交后獲得的雌魚群體。超雄奧尼羅非魚(YY2)為超雄尼羅羅非魚(YY1)與奧尼羅非魚雌魚(WY1)交配后獲得的雄魚群體。羅非魚“粵閩1號”(XY2)為F5代尼羅羅非魚雌魚(XX)與超雄奧尼羅非魚(YY2)雜交后獲得的子代，樣品具體信息見表1。無菌解剖，取其肌肉、肝臟和脾臟，置于液氮中凍存，用于研磨后進(jìn)行同工酶電泳分析；剪取其尾鰭，置于無水乙醇中固定，用于抽提DNA，進(jìn)行mtDNA D-loop區(qū)序列分析。

表1 羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體樣品采集信息

Tab.1 Sampling information of tilapia “Yuemin No.1” and its breeding populations

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 同工酶電泳樣品制備 將1.1中凍存的羅非魚的肌肉、肝臟和脾臟置于0.8%的生理鹽水中，洗滌2次，除去血污，用濾紙吸干后分別稱取約0.25 g組織，置于無菌離心管中。按1∶6(重量g/體積ml)的比例加入預(yù)冷的0.1% mol/L磷酸鹽緩沖液(pH= 7.0)，采用組織勻漿器粉碎組織，置于低溫離心機(jī)中，4℃下12000×g離心20 min，其中，肝臟需離心2次。吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，分裝后置于 ?80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酯酶和乳酸脫氫酶電泳 采用Bio-Rad電泳儀和聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳槽進(jìn)行電泳，酯酶和乳酸脫氫酶電泳所用的非變性聚丙烯酰胺凝膠均為3.75%的濃縮膠和7.5%的分離膠，酯酶電泳采用EBT (pH=8.0)電泳緩沖體系，乳酸脫氫酶電泳采用TC (pH=8.0)緩沖體系，聚丙烯酰胺凝膠體系和電泳緩沖體系參照朱藍(lán)菲(1992)和吳燕燕等(2008)的方法操作。樣品中加入上樣緩沖液，每個(gè)孔點(diǎn)15 μl，先在 4℃下100 V預(yù)電泳40 min，然后調(diào)高電壓至200 V，電泳2~4 h。

1.2.3 同工酶染色、固定及酶譜分析 電泳完畢后，取下凝膠，加入染色液，置于37℃染色30 min，直至酶帶清晰，酯酶染色液和乳酸脫氫酶染色液參照吳燕燕等(2008)的方法配制。染色后，用蒸餾水漂洗2遍，置于7%的醋酸溶液中固定，掃描，根據(jù)酶譜和相對遷移率繪制模式圖，并參照李思發(fā)(1998)的方法對各酶帶進(jìn)行命名和遺傳學(xué)分析。

多態(tài)位點(diǎn)比例=(/)×100%

平均雜合度的觀測值o=1/∑o*

平均雜合度期望值e=1/∑(1?∑i2)

位點(diǎn)有效等位基因數(shù)e=1/∑i

Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)=(o?e)/e

式中，為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)，為所測位點(diǎn)總數(shù)，o*=單個(gè)位點(diǎn)雜合子觀測值/該位點(diǎn)觀察個(gè)體總數(shù)，為第位等位基因的頻率，i為第個(gè)位點(diǎn)的等位基因總數(shù)。

1.2.4 基因組DNA提取 采用動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒(Magen)提取羅非魚尾鰭基因組DNA，操作步驟參照試劑盒說明書。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的完整性，用核酸蛋白定量儀檢測其濃度。

1.2.5 mtDNA D-loop區(qū)擴(kuò)增及測序 羅非魚線粒體DNA D-loop區(qū)擴(kuò)增引物和擴(kuò)增條件參照楊潔等(2014)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后，由廣州艾基生物有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Contig-Express軟件對所測序列進(jìn)行拼接，采用Bioedit軟件對拼接序列進(jìn)行校正，Blast分析表明，所獲序列為羅非魚mtDNA D-loop區(qū)目的片段。采用ClustalW軟件對序列進(jìn)行多重比對，采用DnaSP 5.0軟件計(jì)算單倍型多樣性(Haplotype diversity,)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,P)、平均核苷酸差異數(shù)(Average number of nucleotide differences,)和核苷酸多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(Numbers of polymorphic sites,)，采用Arlequin 3.5軟件計(jì)算遺傳分化指數(shù)(-statistics,ST)和基因流(m)。采用MEGA 5.0軟件中的Kimura 2-Parameter程序計(jì)算群體間遺傳距離，用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建群體間的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 酯酶和乳酸脫氫酶酶譜分析

對羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體中6個(gè)羅非魚群體的肌肉、脾臟和肝臟中的酯酶(EST)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，肌肉和脾臟中EST的表達(dá)量極低，酶譜很淺，無法進(jìn)行辨別；肝臟中的EST表達(dá)量較高，其酶譜和模式圖見圖2。在6個(gè)羅非魚群體肝臟中，共檢測到10條EST酶帶，按遷移率的快慢分別命名為EST-1~EST-10。EST-6~EST-9酶帶顏色較深，酶活力較強(qiáng)；EST-2、EST-3、EST-7 和EST-9酶帶存在于所有羅非魚群體中。YY2群體的酶帶最多(8條)，YY1和WZ群體的酶帶最少 (5條)。羅非魚“粵閩1號”的父本(YY2群體)的主帶為EST-6、EST-7和EST-9，母本(XX群體)的主帶為EST-7、EST-8和EST-9，羅非魚“粵閩1號”(XY2群體)的主帶為EST-6、EST-7、EST-8和EST-9，表現(xiàn)出雜合現(xiàn)象。尼羅羅非魚群體XX和YY1中有EST-8主帶，不含EST-6主帶；奧利亞羅非魚群體WZ與之相反；在奧尼雜交羅非魚群體中，除了YY2群體，在WY1和XY2群體中，同時(shí)出現(xiàn)EST-6和EST-8酶帶。

圖2 羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的肝臟中酯酶的電泳圖譜和模式圖

對6個(gè)羅非魚群體的肌肉、脾臟和肝臟中的乳酸脫氫酶(LDH)進(jìn)行電泳分析。結(jié)果顯示，在3種組織中均能檢測到清晰酶帶，其酶譜和模式圖如圖3所示，共檢測到5條酶帶，根據(jù)其遷移率快慢分別命名為LDH-1~LDH-5。LDH的表達(dá)具有明顯的組織特異性，在肌肉中檢測到5條酶帶(LDH-1~LDH-5)，而在脾臟和肝臟中均檢測到3條酶帶(LDH-2、LDH-3和LDH-5)；LDH-2酶帶在所有組織中顏色均最深。 6個(gè)羅非魚群體肌肉中均含有LDH-1和LDH-2酶帶，WY1群體中含有LDH-3酶帶，XX群體中含有LDH-3、LDH-4和LDH-5酶帶。XY2、YY2和WZ群體脾臟中的LDH酶譜一致，均含有LDH-2、LDH-3和LDH-5酶帶，XX和YY1群體脾臟中的LDH酶譜一致，均含有LDH-2和LDH-3酶帶，WY1群體脾臟中只有LDH-2酶帶。YY2和YY1群體的肝臟中只有LDH-2酶帶，XY2和WZ群體的肝臟中只有LDH-2和LDH-5酶帶，XX群體的肝臟中含LDH-2和LDH-3酶帶，WY1群體的肝臟中含有LDH-2、LDH-3和LDH-5酶帶，且具有個(gè)體差異性。

2.2 同工酶遺傳結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)6個(gè)羅非魚群體組織中酯酶和乳酸脫氫酶電泳酶譜，對其群體遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，不同群體的基因位點(diǎn)數(shù)存在差異(6~9個(gè))，XY2和YY2群體中基因位點(diǎn)數(shù)最多(9個(gè))；6個(gè)羅非魚群體的平均有效等位基因數(shù)(A)為1.13~1.71；多態(tài)性位點(diǎn)比例()為12.50%~71.43%；平均期望雜合度(e)為0.0347~0.3221；平均觀測雜合度(o)為0.0417~ 0.6143；上述4個(gè)遺傳學(xué)參數(shù)均在XX群體中的值最大，在WZ群體中的值最小；6個(gè)羅非魚群體中，哈迪-溫伯格平衡偏離指數(shù)()為?0.2347~0.9072，其中，WY1群體最小(?0.2347)，XX群體最大(0.9072)(表2)。

圖3 羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的不同組織中乳酸脫氫酶的電泳圖譜和模式圖

表2 基于酯酶和乳酸脫氫酶的遺傳結(jié)構(gòu)分析

Tab.2 Genetic structure analysis based on EST and LDH

2.3 mtDNA D-loop區(qū)序列變異和單倍型分析

通過PCR產(chǎn)物雙向測序、拼接、比對和人工校正，獲得羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體共7個(gè)群體的線粒體DNA控制區(qū)序列880 bp。7個(gè)羅非魚群體mtDNA D-loop區(qū)的堿基組成之間無顯著差異，C、T、A和G的平均含量分別為22.28%、31.86%、31.54%和14.33%，A+T含量(63.39%)明顯高于G+C含量(36.61%)。在880個(gè)位點(diǎn)中包括保守位點(diǎn)737個(gè)，增添/缺失位點(diǎn)16個(gè)，變異位點(diǎn)127個(gè)(3個(gè)單堿基變異位點(diǎn)和124個(gè)簡約信息位點(diǎn))，變異位點(diǎn)在序列中的分布情況見表3。

在7個(gè)羅非魚群體共140條序列中共發(fā)現(xiàn)20種單倍型(表3)，其在不同群體中的分布情況見表4。 20種單倍型中共享單倍型有8種(40%)，12種為群體特異性單倍型(60%)。Hap-2和Hap-19單倍型的共享率最高，為4個(gè)羅非魚群體共享。YY1群體只有 1種單倍型，其他群體的單倍型數(shù)為5~6種。WY1、XX、XY2、XY、YY1、WZ和YY2群體的優(yōu)勢單倍型分別是Hap-2/Hap-19、Hap-7、Hap-2、Hap2/Hap7、Hap5、Hap-10和Hap-10。

2.4 群體遺傳多樣性和遺傳分化

通過DnaSP 5.0軟件對7個(gè)羅非魚群體的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，WY1、XX、XY2和XY 4個(gè)群體的單倍型多樣性(d)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)()、平均核苷酸差異數(shù)()、核苷酸多樣性指數(shù)(P)都明顯高于YY1、YY2和WZ 3個(gè)群體的相應(yīng)值，其中，YY1群體的遺傳多樣性最低(表5)。通過用MEGA 5.0軟件中的Kimura 2-Parameter模型計(jì)算群體內(nèi)和群體間遺傳距離。結(jié)果顯示，WY1群體內(nèi)的遺傳距離最大(0.0564)，YY1群體內(nèi)的遺傳距離最小(0)；WZ群體與YY2群體之間的遺傳距離最小(0.0008)，XX群體與WZ、YY2群體之間的遺傳距離最大(0.1043)。XY2群體與奧利亞羅非魚群體(WZ)之間的遺傳距離(0.0695)大于其與尼羅羅非魚群體(XX、XY)之間的遺傳距離(0.0639) (表6)。通過Arlequin 3.5軟件計(jì)算群體間遺傳分化指數(shù)(ST)和基因流(m)。結(jié)果顯示，除了XY2與WY1群體之間、XX與XY群體之間及WZ與YY2群體之間的遺傳分化不顯著(ST<0.05,>0.05)之外，其他群體之間均存在極顯著的遺傳分化(ST>0.05,0.01)；WY1與XY2群體之間、XY2與XX群體之間、XY與WY1群體之間、XY與XX群體之間以及XY與XY2之間的基因流N>1，而其他群體之間的基因流N<1 (表7)。

表4 羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的單倍型及其分布

Tab.4 The haplotypes and their distribution in the tilapia “Yuemin No.1” and its breeding populations

2.5 群體遺傳進(jìn)化關(guān)系

根據(jù)群體之間的遺傳距離，采用MEGA 5.0軟件中的鄰接法構(gòu)建群體間的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，7個(gè)羅非魚群體可以聚為兩大支，XX、XY、YY1和XY2群體聚為一支，WY1、WZ和YY2群體聚為另一支，XY2群體與尼羅羅非魚的親緣關(guān)系比其與奧利亞羅非魚的親緣關(guān)系近(圖4)。

表5 羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的遺傳多樣性參數(shù)

Tab.5 Genetic diversity paramaters of tilapia “Yuemin No.1” and its breeding populations

表6 羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體間(左下)和群體內(nèi)遺傳距離(對角線)

Tab.6 Genetic distance among (left lower) and within (diagonalline) tilapia “Yuemin No.1” and its breeding populations

表7 羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體遺傳分化指數(shù)FST(右上)和基因流m(左下)

Tab.7 Gene flow(left lower) and genetic differentiation (upper right) of tilapia “Yuemin No.1” and its breeding populations

** 表示差異極顯著，<0.01

** represented highly significant difference,<0.01

圖4 基于mtDNA D-loop區(qū)序列構(gòu)建的羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

3.1 同工酶酶譜的群體和組織特異性

EST是一種水解酶類，除維持正常的能量代謝外，還可以催化酯類化合物水解為相應(yīng)的醇和酸 (韓慶等, 2015)。本研究表明，在羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體共6個(gè)群體的肌肉和脾臟中EST表達(dá)量極低，而肝臟中的EST表達(dá)量較高，具有明顯的組織特異性，與李思發(fā)等(1995)的研究結(jié)果類似，這可能與魚類肝臟中脂類代謝旺盛，具有降解代謝廢物和毒素的解毒功能有關(guān)(韓慶等, 2015)。大多數(shù)魚類的EST為單體，通常由2個(gè)以上的等位基因控制，多態(tài)性現(xiàn)象普遍，酶譜復(fù)雜(熊全沫, 1992)。楊淞等(2006)在荷那龍羅非魚()和莫桑比克羅非魚()中共檢測到13條EST酶帶。本研究在6個(gè)羅非魚群體肝臟中共檢測到10條EST酶帶，YY2群體中酶帶最多(8條)，YY1和WZ群體中酶帶最少(5條)，且存在個(gè)體差異性，這說明不同羅非魚種類或群體的EST表達(dá)具有特異性。羅非魚“粵閩1號”的EST的酶譜與其父母本群體相比，表現(xiàn)出雜合現(xiàn)象，該現(xiàn)象也同樣出現(xiàn)在奧尼雜交羅非魚群體中，這說明EST-8為尼羅羅非魚特有譜帶，EST-6為奧利亞羅非魚特有譜帶，由不同的等位基因控制，雜交子代中可同時(shí)獲得這2個(gè)譜帶。LDH是一種四聚體糖酵解酶，主要參與乳酸的產(chǎn)生和利用，它可在無氧條件下將丙酮酸還原為乳酸，產(chǎn)能以維持機(jī)體的能量需求(楊玲等, 2014)。羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的LDH酶譜具有組織和群體特異性，在肌肉中檢測到 5條酶帶，而在脾和肝臟中都只檢測到3條酶帶，這可能與肌肉中無氧代謝較旺盛有關(guān)。

3.2 群體遺傳多樣性

多態(tài)性位點(diǎn)比例()和平均雜合度()是評估魚類群體遺傳變異及多態(tài)性的重要指標(biāo)。研究表明，淡水魚類的多態(tài)性位點(diǎn)比例為0.118~0.333，平均雜合度為0.080~0.100，均值為0.043；海水魚類的平均雜合度為0.029~0.088，均值為0.063 (Gyllensten, 1985; 徐成等, 2001)。本研究對6個(gè)羅非魚群體不同組織中EST和LDH電泳酶譜進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，多態(tài)性位點(diǎn)比例()為12.50%~71.43%，平均觀測雜合度(o)為0.0417~0.6143，這說明6個(gè)羅非魚群體多樣性處于較高水平，遺傳多樣性較豐富。Hardy- Weinberg遺傳偏離指數(shù)()用于檢驗(yàn)群體的遺傳平衡狀況，值越趨于0，該群體的基因分布就越接近平衡狀態(tài)，>0表明雜合子過剩，<0表明雜合子缺失(楊元昊等, 2015)。本研究表明，6個(gè)羅非魚群體的Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)()為?0.2347~0.9072，其中，WY1群體最小(?0.2347)，XX群體最大(0.9072)，說明WY1群體存在雜合子缺失現(xiàn)象，遺傳變異較小，而其他群體表現(xiàn)為不同程度的雜合子過?，F(xiàn)象，其中XX群體遺傳變異最大，遺傳多樣性最高。

由于同工酶只能檢測基因表達(dá)產(chǎn)物，易受外界環(huán)境和表達(dá)調(diào)控的影響，反映的遺傳變異和親緣關(guān)系不夠全面。因此，本研究進(jìn)一步利用mtDNA D-loop區(qū)部分序列對羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究。研究表明，羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體共7個(gè)群體的mtDNA D-loop區(qū)序列的堿基組成差異較小，均呈現(xiàn)出A+T堿基偏向性(63.39%)，這與脊椎動(dòng)物線粒體DNA序列的特點(diǎn)相一致(Broughton, 2001)。在7個(gè)羅非魚群體中共發(fā)現(xiàn)20種單倍型，多數(shù)群體的單倍型數(shù)為5~6種，YY1群體只有1種單倍型，其單倍型多樣性(d)為0，說明YY1群體的遺傳多樣性較低，這與YY1群體來自尼羅羅非魚雄魚與尼羅羅非魚偽雌魚交配獲得，近親繁殖嚴(yán)重，子代趨于純合有關(guān)。核苷酸多樣性(P)是分子遺傳學(xué)中評價(jià)遺傳多樣性的重要指標(biāo)，楊潔等(2014)對8個(gè)養(yǎng)殖尼羅羅非魚群體的研究結(jié)果顯示，其P值為0.0008~0.0569；本研究中的7個(gè)羅非魚群體的P值為0~0.0519，與其結(jié)果相近，WY1、XX、XY2和XY群體的P值(0.0440~0.0519)明顯高于YY1、YY2和WZ群體的P值(0~0.0009)，說明WY1、XX、XY2和XY群體的遺傳多樣性較高，而YY1、YY2和WZ群體的遺傳多樣性較低。雖然YY1、YY2和WZ群體的高度純合現(xiàn)象有利于其優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳，但作為羅非魚“粵閩1號”的繁育群體，高度純合不利于這些純種的保存和復(fù)壯。因此，應(yīng)該擴(kuò)大選育群體數(shù)量，避免過度近親繁殖和遺傳漂變導(dǎo)致群體遺傳多樣性的下降和優(yōu)良性狀的衰退(吳長敬等, 2010)。

3.3 群體間的遺傳差異與親緣關(guān)系

同工酶譜差異是由同工酶基因變異導(dǎo)致同工酶結(jié)構(gòu)差異所引起。一般認(rèn)為，酶帶相似則同工酶的氨基酸組成也相似，因而可能具有較近的親緣關(guān)系；若酶譜差異較大，則表明在生化水平上存在一定分化(Janko, 2007; 魏玉眾等, 2017)。XY2、YY2和WZ群體脾臟中的LDH酶譜一致，XX和YY1群體脾臟中的LDH酶譜一致，說明這些酶譜相似的群體之間的親緣關(guān)系較近。

遺傳分化指數(shù)(ST)是評價(jià)群體間遺傳分化程度的重要指標(biāo)，ST<0.05時(shí)，表明群體間無遺傳分化(Wright, 1978)。本研究表明，7個(gè)羅非魚群體之間的ST為?0.0115~0.9963，除了XY2與WY1群體之間、XX與XY群體之間以及WZ和YY2群體之間的遺傳分化不顯著(>0.05)之外，其他群體之間均存在極顯著的遺傳分化(0.01)，這表明羅非魚“粵閩1號”與尼羅羅非魚群體和奧利亞羅非魚群體均存在顯著遺傳分化，而與奧尼雜交羅非魚WY1群體遺傳分化不明顯。XY2群體與尼羅羅非魚群體(XX和XY群體)之間的基因流m>1，說明它們之間的遺傳分化主要由基因流引起，而XY2群體與奧利亞羅非魚群體(WZ群體)之間的基因流m<1，其遺傳分化主要由遺傳漂變導(dǎo)致(Slatkin, 1987)。

群體間遺傳距離直接反映了各群體之間的親緣關(guān)系，本研究表明，XY2群體與其父母本(YY2群體♂和XX群體♀)的遺傳距離分別為0.0696和0.0677，其與母本的親緣關(guān)系較近，這與mtDNA為母系遺傳有關(guān)。XY2的父本(YY2群體)與奧利亞羅非魚群體(WZ群體)的親緣關(guān)系明顯近于尼羅羅非魚群體(XX群體和XY群體)，這有利于XY2群體最大限度地獲得奧利亞羅非魚的優(yōu)良性狀。本研究還顯示，XY2群體與尼羅羅非魚群體(XX群體和XY群體)的平均遺傳距離為0.0639，與奧利亞羅非魚群體(WZ群體)之間的遺傳距離為0.0695，在構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹中，XY2群體也與尼羅羅非魚群體(XX和XY群體)聚為一大支，表明XY2群體與尼羅羅非魚的親緣關(guān)系較近，而與奧利亞羅非魚的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

Broughton RE, Milam JE, Roe BA,. The complete sequence of the zebrafish () mitochondrial genome and evolutionary patterns in vertebrate mitochondrial DNA. Genome Research, 2001, 11(11): 1958?1967

Ding JQ, Liu P, Li J,. Genetic variation analysis of four geographic populations ofby isozyme. Progress in Fishery Sciences, 2013, 34(2): 82?89 [丁金強(qiáng), 劉萍, 李健, 等. 日本蟳4個(gè)地理群體遺傳變異的同工酶分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2013, 34(2): 82?89]

Gyllensten U. The genetic structure of fish: Differences in the intraspecific distribution of biochemical genetic variation between marine, anadromous, and freshwater species. Journal of Fish Biology, 1985, 26(6): 691?699

Han Q, Zhao DH. Comparative study on three isozymes in different tissues of catfish () with different color in Dongting Lake. Guangdong Agricultural Sciences, 2015(2): 104?107, 113 [韓慶, 趙東海. 洞庭湖不同體色鲇不同組織同工酶的比較研究. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015(2): 104?107, 113]

Hu YT, Hu W, Jiang H,. Sequence and phylogenetic analysis of the complete mitochondrial genome of Chuzhou Crucian Carp (). Progress in Fishery Sciences, 2015, 36(5): 63?70 [胡玉婷, 胡王, 江河, 等. 滁州鯽()線粒體全基因組序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(5): 63?70]

Janko K, Flaj?hans H, Choleva L,. Diversity of European spined loaches (genusL.): An update of the geographic distribution of thehybrid complex with a description of new molecular tools for species and hybrid determination. Journal of Fish Biology, 2007, 71(Suppl C): 387?408

Li SF, Cai WQ. Introgression in hatchery stocks ofandin China. Journal of Fisheries of China, 1995, 19(2): 105?111 [李思發(fā), 蔡完其. 我國尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚養(yǎng)殖群體的遺傳漸滲. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1995, 19(2): 105?111]

Li SF. Genetical characterization of major freshwater culture fishes in China. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 1998, 189?193 [李思發(fā). 中國淡水主要養(yǎng)殖魚類種質(zhì)研究. 上海: 上?？萍汲霭嫔? 1998, 189?193]

Liu H, Zhang HQ, Cai SL,. Analysis of the genetic diversity of six populations of culturedbased on the mitochondrial DNA control region. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(1): 63?73 [劉紅, 張海強(qiáng), 蔡生力, 等. 基于線粒體DNA控制區(qū)序列的6個(gè)凡納濱對蝦()養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2016, 37(1): 63?73]

Slatkin M. Gene flow and the geographic structure of natural populations. Science, 1987, 236(4803): 787?792

Teletchea F. Molecular identification methods of fishspecies: Reassessment and possible applications. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 2009, 19(3): 265?293

Wei YZ, Zhang GR, Huo B,. A comparative study on lactate dehydrogenase isozymes in six species of. Freshwater Fisheries, 2017, 47(5): 3?8 [魏玉眾, 張桂蓉, 霍斌, 等. 雅魯藏布江中游6種裂腹魚乳酸脫氫酶同工酶的比較研究. 淡水漁業(yè), 2017, 47(5): 3?8]

Wright S. Evolution and the genetics of populations: Variability within and among natural populations. Chicago: University of Chicago Press, 1978, 580

Wu CJ, Zou ZY, Yang H,. Structure of the mitochondrial DNA D-Loop region and analysis of genetic diversity in different strains of tilapia (). Chinese Journal of Zoology, 2010, 45(5): 121?128 [吳長敬, 鄒芝英, 楊弘, 等. 羅非魚mtDNA D-loop區(qū)部分序列結(jié)構(gòu)和種群遺傳多樣性分析. 動(dòng)物學(xué)雜志, 2010, 45(5): 121?128]

Wu YY, Li LH, Han JL. Studies on four isozyme from several tissues of Jifu tilapia. Biotechnology Bulletin, 2008(Suppl), 319?323 [吳燕燕, 李來好, 韓君莉. 吉富羅非魚不同組織中4種同工酶研究. 生物技術(shù)通報(bào), 2008(增刊): 319?323]

Xie XY, Li SF. Comparison of base sequence diversity of Cytb and D-loop gene of Nile tilapia. Genomics and Applied Biology, 2014, 33(5): 982?985 [頡曉勇, 李思發(fā). 羅非魚選育群體Cytb與D-loop序列變異信息對比分析. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2014, 33(5): 982?985]

Xiong QM. Isozymesanalysis of fishes (Vol. 1). Hereditas (Beijing), 1992, 14(2): 41?44, 48 [熊全沫. 魚類同工酶譜分析(上). 遺傳, 1992, 14(2): 41?44, 48]

Xu C, Wang KL, You F,. Biochemical genetics ofpopulation Ⅰ biochemical genetic analysis of isozymes. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2001, 32(1): 42?49 [徐成, 王可玲, 尤鋒, 等. 鱸魚群體生化遺傳學(xué)研究Ⅰ同工酶的生化遺傳分析. 海洋與湖沼, 2001, 32(1): 42?49]

Yang J, He AY, He XJ,. Genetic diversity and relationships of mitochondrial DNA control region from the eight domesticated populations of Nile tilapia. Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 21(4): 693?699 [楊潔, 何安元, 何學(xué)軍, 等. 尼羅羅非魚8個(gè)養(yǎng)殖群體線粒體控制區(qū)遺傳多樣性和遺傳關(guān)系分析. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2014, 21(4): 693?699]

Yang L, Lu H, Liu YQ,. Study on the tissue specificity of 8 isozymes infrom Dongping Lake. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2014, 30(14): 26?32 [楊玲, 盧紅, 劉羽清, 等. 東平湖鯉8種同工酶的組織特性研究. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014, 30(14): 26?32]

Yang S, Huang ZH, Ye X,. Preliminary study on three isozymes ofand. Journal of Dalian Fisheries University, 2006, 21(2): 122?126 [楊淞, 黃樟翰, 葉星, 等. 荷那龍羅非魚和莫桑比克羅非魚3種同工酶的分析. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 21(2): 122?126]

Yang YH, Zhou JS, Li L,. Preliminary analysis on isozymes in different tissues and population genetic structure of. Freshwater Fisheries, 2015, 45(1): 25?29 [楊元昊, 周繼術(shù), 李蕾, 等. 蘭州鲇不同組織同工酶及群體遺傳結(jié)構(gòu)初步分析. 淡水漁業(yè), 2015, 45(1): 25?29]

Zhu LF. Gradient gel electrophoresis on polyacrylamide of isozymes and proteins of fishes. Acta Hydrobiologica Sinica, 1992, 16(2): 183?185 [朱藍(lán)菲. 魚類同工酶和蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳法. 水生生物學(xué)報(bào), 1992, 16(2): 183?185]

Genetic Diversity and Genetic Relationship Analysis of Tilapia “Yuemin No.1” and Its Breeding Populations

LIU Zhigang, LU Maixin①, CAO Jianmeng, GAO Fengying

(Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fisheries Science, Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510380)

“Yuemin No.1” is a novel holandric species of tilapia, which was bred withand. In order to reveal the genetic characteristics of tilapia “Yuemin No.1,” the genetic diversity, genetic structure, and genetic relationships among groups of tilapia “Yuemin No.1” and its breeding populations were studied by isozyme electrophoresis and sequence analysisof the D-loop region of mtDNA. The results of isozyme electrophoresis showed that the zymogram of esterase (EST) and lactate dehydrogenase (LDH) werepopulation- and tissue-specific in tilapia. The expression level of EST in the muscle and spleen was extremely low, whereas that in the liver was high. LDH was highly expressed in all the tissues, as revealed by the different zymograms. Ten bands of EST and five of LDH were detected in tilapia “Yuemin No.1” and its breeding populations. The proportion of polymorphic loci () ranged from 12.50% to 71.43%, the average observed heterozygosity (o) ranged from 0.0417 to 0.6143, and the Hardy-Weinberg genetic deviation index () ranged from ?0.2347 to 0.9072. The result of sequence analysis of the D-loop region of mtDNA revealed that no significant difference occurred in base composition, and that A+T content (63.39%) bias was widespread in all the populations. There were 20 haplotypes in tilapia “Yuemin No.1” and its breeding populations. The nucleotide diversity index (P) ranged from 0 to 0.0519. ThePvalue of WY1, XX, XY2, and XY populations (0.0440~0.0519) were significantly higher than that of YY1, YY2, and WZ populations (0~0.0009). The genetic differentiation index (ST) among populations ranged from ?0.0115 to 0.9963. There was no significant genetic differentiation (ST<0.05,>0.01) between the XY2 and WY1, XX and XY, and WZ and YY2 populations. The average genetic distance between XY2 population and(XX and XY populations) was 0.0639, whereas that between the XY2 population and(WZ population) was 0.0695. Cluster analysisrevealed two clusters; one cluster included XY, XX, YY1, and XY2 populations, and the othercluster included WY1, WZ, and YY2 populations. This study revealed the biochemical and molecular genetic features of tilapia “Yuemin No.1,” and provide research data for germplasm identification, establishment of breeding populations, and maintainence of stable inheritance of desirable traits.

Tilapia “Yuemin No.1”; Isozyme; Mitochondrial DNA control region; Genetic diversity; Genetic relationship

LU Maixin, E-mail: mx-lu@163.com

劉志剛, 盧邁新, 曹建萌, 高風(fēng)英. 羅非魚“粵閩1號”及其繁育群體的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(6): 31–41

Liu ZG, Lu MX, Cao JM, Gao FY. Genetic diversity and genetic relationship analysis of tilapia “Yuemin No.1” and its breeding populations. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(6): 31–41

* 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(CARS-46)、廣東省自然科學(xué)基金(2016A030313146)和廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201803020034)共同資助[This work was supported by China Agriculture Research System (CARS-46), Natural Science Foundation of Guangdong Province(2016A030313146), and Science and Technology Program of Guangzhou(201803020034)]. 劉志剛，E-mail: wenliugang@163.com

盧邁新，研究員，E-mail: mx-lu@163.com

2018-04-28,

2018-05-21

10.19663/j.issn2095-9869.20180428001

S917.4

A

2095-9869(2018)06-0031-11

(編輯 馬璀艷)