利用復(fù)合酶結(jié)合超聲法提取沙棘葉黃酮

陳 春

(山西省林業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030012)

1 引言

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)是胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(HippophaeLinn.)多年生灌木。沙棘富含多種營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)，其中沙棘黃酮具有抗氧化延遲衰老、增強免疫功能、調(diào)節(jié)血糖血脂、抑制腫瘤生長、抗心血管疾病等藥理作用[1]。研究表明沙棘葉黃酮含量明顯高于果實，并且沙棘葉利用成本遠(yuǎn)低于沙棘果實[2]。

黃酮主要的提取方法包括：水提取法、有機溶劑提取法、微波輔助提取法[3]、超聲波輔助提取、酶提取法等[4～6]。本研究將乙醇提取法、超聲輔助提取法[7]和復(fù)合酶提取法[8]相結(jié)合，目的是通過實驗獲得最佳的提取工藝條件，為沙棘葉黃酮提取的生產(chǎn)和研究提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 沙棘葉片

沙棘葉片采摘于山西省關(guān)帝山國有林管理局三道川中心林場龍興工區(qū)。

2.1.2 實驗用試劑和酶

本實驗主要試劑包括：蘆丁標(biāo)品，批號: 100080-200707，中國藥品生物制品檢定所；復(fù)合酶由寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；果膠酶由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；其它試劑均為分析純試劑。

2.1.3 實驗儀器

實驗過程中主要用到的儀器設(shè)備有：GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)；QE-500高速粉碎機(浙江屹立工貿(mào)有限公司)；SB25-12超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；721紫外可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

2.2 試驗方法

2.2.1 樣品的預(yù)處理

將采摘的沙棘葉置于干燥箱中，在60 ℃溫度條件下干燥24 h，取出干燥后的沙棘葉片去掉小枝，用粉碎機將沙棘葉片粉碎后過40目篩，裝入樣品袋，放入干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

2.2.2.1 對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

總黃酮對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：用萬分之一天平上稱取蘆丁20 mg,用60%乙醇將蘆丁通過水浴微熱使溶解于100 mL容量瓶中,加適量,冷卻至室溫后,繼續(xù)添加60%乙醇定容，得到蘆丁濃度為0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸取0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL于25 mL容量瓶,依次分別加入30%乙醇至6 mL、5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL、0 mL，搖勻；繼續(xù)加入1 mL的5%NaNO2溶液,搖勻后靜置6 min；加入1 mL的30%Al(NO3)3溶液,搖勻靜置6 min；最后加入10 mL的10%NaOH溶液,加30%乙醇至刻度,搖勻靜置15 min。在波長為510 nm處測定吸光度。曲線X軸為蘆丁的梯度濃度值,Y軸為對應(yīng)的吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 沙棘總黃酮含量測定

將沙棘葉黃酮提取的液渣混合物過濾除去葉渣，用移液槍吸取1 mL提取液于25 mL容量瓶,然后利用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法在波長為510 nm條件下測定吸光度。根據(jù)樣品中黃酮含量(mg/g)=(c×d×v)/r的公式計算，c為通過標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計算所得質(zhì)量濃度(mg/mL),d為稀釋倍數(shù),v為提取液總體積(mL)，r為沙棘葉粉的重量(g)。

2.2.4 沙棘葉提取單因素影響試驗

2.2.4.1 用酶量對沙棘葉黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，液料比20∶1,加入60%乙醇10 mL,超聲功率200 W,提取溫度50 ℃,提取時間60 min,酶用量分別是沙棘葉粉質(zhì)量的1%、2%、3%、4%、5%和6%的梯度條件下提取沙棘葉總黃酮。

2.2.4.2 溫度對沙棘葉總黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，液料比為20∶1，加入60%乙醇10 mL,設(shè)置超聲功率200 W,提取時間60 min,提取用酶質(zhì)量百分比為沙棘葉粉質(zhì)量的4%，在提取溫度20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃的梯度溫度下提取沙棘葉總黃酮。

2.2.4.3 時間對沙棘葉總黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，液料比為20∶1，加入60%乙醇10 mL,設(shè)置超聲功率200 W,酶質(zhì)量百分比為沙棘葉粉質(zhì)量的4%，提取溫度50 ℃,在提取時間為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、 80 min的梯度條件下提取沙棘葉總黃酮。

2.2.4.4 超聲功率對沙棘葉總黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，液料比為20∶1，加入60%乙醇10 mL,酶質(zhì)量為沙棘葉粉質(zhì)量的4%，提取溫度50 ℃,提取時間為60 min，分別設(shè)置超聲功率為200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W、500 W梯度條件下提取沙棘葉總黃酮。

2.2.4.5 液料比對沙棘葉總黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，酶質(zhì)量為沙棘葉粉質(zhì)量的4%，提取溫度50 ℃,提取時間為60 min，設(shè)置超聲功率為200 W，在液料比為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1梯度條件下提取沙棘葉總黃酮，即分別加入60%乙醇5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL。

2.2.4.6 乙醇濃度對沙棘葉總黃酮提取的影響

稱量沙棘葉粉0.5 g，酶質(zhì)量為沙棘葉粉質(zhì)量的4%，提取溫度50 ℃,提取時間為60 min，設(shè)置超聲功率為200 W，在液料比20∶1，分別加入10 mL體積百分比濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇提取沙棘葉總黃酮。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本實驗利用軟件Origin2017軟件處理分析實驗數(shù)據(jù)并繪制數(shù)據(jù)圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

如圖1所示即為蘆丁吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，由軟件origin 2017經(jīng)線性回歸得回歸方程y=-7.03571E+12.1799X，相關(guān)系數(shù)R2=0.99937，在0.008 mg/mL～0.06 mg/mL區(qū)間范圍內(nèi)線性回歸關(guān)系良好。

3.2 單因素試驗結(jié)果分析

3.2.1 提取用酶量對沙棘葉黃酮提取的影響

如圖2所示，通過在超聲輔助條件下利用乙醇對沙棘葉黃酮的提取過程中，添加酶會有效提高沙棘葉黃酮的提取效率，通過改變酶相對于沙棘葉粉的質(zhì)量百分比，進(jìn)一步研究沙棘葉黃酮提取效率同酶用量的關(guān)系。從圖2可知，添加復(fù)合酶5%時，提取效率最高，添加果膠酶6%時，提取效率最高。

圖1 蘆丁吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 酶質(zhì)量百分比對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.2.2 溫度對沙棘葉總黃酮提取的影響

由圖3可以看出，提取沙棘葉黃酮時無酶添加情況下，隨著溫度的升高沙棘葉黃銅的析出逐漸增大，當(dāng)提取溫度增加至60 ℃時再繼續(xù)增加溫度對提取率變化不明顯。在添加復(fù)合酶和果膠酶單酶的條件下，溫度為50 ℃，提取率均達(dá)到最大，之后由于溫度的升高讓酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變性影響到對酶解反應(yīng)的生物催化作用，提取率呈下降趨勢。

圖3 溫度對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.2.3 時間對沙棘葉總黃酮提取的影響

由圖4可以看出，隨著提取時間的延長，沙棘葉總黃酮析出量將不斷增大，當(dāng)達(dá)到70 min以上時，沙棘葉總黃酮含量將再基本保持不變。從圖中可以看出，當(dāng)提取時間為60 min時，添加復(fù)合酶和果膠酶，提取黃酮的含量均達(dá)到最大值，并且添加復(fù)合酶的提取效率高于果膠酶。

圖4 時間對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.2.4 超聲功率對沙棘葉總黃酮提取的影響

由圖5所示，根據(jù)超聲的功率設(shè)定范圍從200～500 W，從圖中可以明確看出在使用酶輔助的條件下沙棘葉黃酮提取率高于無酶添加，并且復(fù)合酶的提取效率高于單酶果膠酶，均在300 W時達(dá)到最大提取效率。

圖5 超聲功率對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.2.5 液料比對沙棘葉總黃酮提取的影響

由圖6所示，添加復(fù)合酶輔助提取沙棘葉黃酮時當(dāng)液料比為30∶1時，提取效果最好；使用果膠酶時液料比為20∶1提取率最高。無酶添加時隨著液料比的增加，沙棘葉黃酮提取效率不斷增加，當(dāng)達(dá)到液料比為40∶1和50∶1時基本沒有變化。

圖6 液料比對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.2.6 乙醇分?jǐn)?shù)對沙棘葉總黃酮提取的影響

由圖7可知，在使用生物酶輔助提取沙棘葉黃酮的過程中，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，沙棘葉黃酮的析出均是先快速提高，復(fù)合酶在乙醇體積濃度為50%，果膠酶在30%達(dá)到最大提取效率，然后再緩慢降低，主要原因是高濃度的乙醇能使蛋白變性從而使酶失去活性。在無酶條件的對照組可以看出，隨著乙醇濃度升高沙棘葉黃酮的提取效率呈正相關(guān)，但當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加沙棘葉黃酮提取效率基本不變。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對沙棘葉總黃酮提取的影響

3.3 單酶和復(fù)合酶對沙棘葉黃酮提取的對比

從圖3～7的多個單因素對沙棘葉黃酮提取影響的對比實驗可以看出，提取沙棘葉黃酮過程中添加酶可以有效提高沙棘葉中黃酮的提取率，同時添加復(fù)合酶對沙棘葉總黃酮的提取要明顯優(yōu)于添加果膠酶單酶。

4 討論與結(jié)論

(1)通過將乙醇提取法、超聲提取法、酶提取法3種沙棘葉提取方法結(jié)合，可以有效提高沙棘葉黃酮的提取效果，并且不會引入有毒有害物質(zhì)，提取液易于分離回收，具有很好的生產(chǎn)實踐意義。

(2)通過實驗優(yōu)化后的提取條件：使用復(fù)合酶，酶質(zhì)量百分比5%，時間60 min，超聲功率300 W，溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比30∶1。在優(yōu)化后的提取條件下，提取沙棘葉黃酮。在優(yōu)化后的提取條件下，提取沙棘葉總黃酮，最后的得率為1.78%。

(3)通過兩種不同的酶作用于沙棘葉，復(fù)合酶和果膠酶。其中復(fù)合酶成分包括果膠酶、半纖維素酶、阿拉伯聚糖酶、β-葡聚糖等酶，由于酶之間有較強的協(xié)同作用，相互促進(jìn)，加速細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分解，促進(jìn)黃酮類物質(zhì)進(jìn)一步釋放，復(fù)合酶提取沙棘葉黃酮的效果優(yōu)于果膠酶單酶。因此在相同的條件下優(yōu)選添加復(fù)合酶作為輔助來提取沙棘葉總黃酮，可以節(jié)約酶的使用量，降低提取成本，提高提取沙棘葉黃酮的提取率。

ExtractionofFlavonoidsinSeaBuckthornLeavesbyUsingCombinedEnzymeAssistedwithUltrasonicMethod

Chen Chun

(ShanxiAcademyofForestSciences,TaiyuanShanxi, 030012,China)

Abstract: Sea buckthorn (Hippophaerhamnoides L.) leavesare rich in many active components,among which the flavonoids have high health care and medical value.In this study, the total flavonoids in the leave of Sea buckthorn are extracted by using the combined enzyme assisted with ultrasonic method. Through the single-factor experiments, the extraction of flavonoids in leaves has been optimized. The experiment results indicate that the optimum extraction conditions for flavonoids aremass percentage of the combined enzyme 5%,60min, ultrasonic power300w, temperature50℃, ethanol volume fraction 50%, and liquid-solid ratio30:1. The experiment also shows extraction efficiency of combined enzyme is significantly higher than individual enzyme.

Keywords: sea buckthorn leaves;Flavonoids; ultrasonic method; complex enzyme