纖維素原料在不同預(yù)處理體系中的多維表征

張樂平 尤宜嬌 徐靜靜 馬路 王巍 彭何歡

摘? 要：為了研究不同纖維素原料在液氨預(yù)處理（LAT）和過氧化氫液氨聯(lián)合預(yù)處理（HP-LAT）下的酶解率及酶解率差異的原因。以芒、楊木、玉米秸稈和竹子四種植物為纖維素原料，分別進行LAT預(yù)處理（預(yù)處理溫度：130℃，駐留時間：10min，固液比：4：3，氨用量比：2.0）及HP-LAT預(yù)處理（預(yù)處理溫度：130℃，駐留時間：10min，固液比：4：3，氨用量比：2.0，過氧化氫用量比：5：3），酶解預(yù)處理產(chǎn)物，測其酶解率，并對各類產(chǎn)物進行紅外光譜分析。通過實驗發(fā)現(xiàn)，芒在經(jīng)過HP-LAT預(yù)處理后，酶解率最高（葡聚糖酶解率：85.15%，木聚糖酶解率：85.73%）。由紅外光譜圖以及超景深顯微分析可知在這3種預(yù)處理條件中，HP-LAT預(yù)處理對木質(zhì)纖維素內(nèi)部鍵、基團的破壞程度最好，最有利于酶解;在這4種木質(zhì)素原料中，在相同實驗條件下，芒內(nèi)部的鍵、基團破壞情況最有利于酶解。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素;預(yù)處理;過氧化氫;酶解;紅外色譜分析

中圖分類號：KT6;S216? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.11974/nyyjs.20180932003

木質(zhì)纖維素原料是地球上一種儲存量極大的生物質(zhì)能源，也是目前利用率極低的一種可再生能源，其也是各國新資源戰(zhàn)略的重點之一[1，2]。木質(zhì)纖維素原料通過預(yù)處理、酶解、發(fā)酵，可生成乙醇。我國目前雖然是世界上第3大乙醇生產(chǎn)國，但木質(zhì)纖維素制乙醇產(chǎn)業(yè)還不是很完備。預(yù)處理具有提高產(chǎn)率的作用，目前預(yù)處理工藝主要分為4種，主要有化學(xué)法、物理法、物理化學(xué)法及生物法[3-5]。田慶文[6]研究發(fā)現(xiàn)氨聯(lián)合磨盤預(yù)處理玉米秸稈的聚糖轉(zhuǎn)化率達到66%，具有很好的預(yù)處理效果。根據(jù)蔡彥[7]的研究，氨具有較強的消除木質(zhì)素的能力，可用于木質(zhì)纖維素的預(yù)處理工藝。何士成[8]的研究表明，氨爆可提高麥稈的酶解效率，纖維素轉(zhuǎn)化率達80.53%。趙超[9]采用液氨過氧化氫聯(lián)合預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)此預(yù)處理可有效除去纖維素中的木質(zhì)素。

1? ? ?材料與實驗方法

1.1? ? ?材料的特點及采集方法

本研究實驗室位于浙江省臨安市（30o23N，119o52E）浙江農(nóng)林大學(xué)，實驗原材料都是選用本地生長的芒、楊木、竹子和玉米秸稈。芒與玉米秸稈于2016年12月進行采收，生長時長約為1a;竹子與楊木采于2016年12月進行采收，生長時長約為3a。收割原材料后，將原材料切割為2cm左右的長條狀，然后將其烘干至含水率小于15%，接著用粉碎機將其粉碎，過100目篩，然后密封置于-20℃冷藏柜內(nèi)冷藏。

1.2? ? ?試驗設(shè)備及試劑

試驗中需要用到的一些儀器及分析設(shè)備有：真空過濾泵（AP-01D型，天津Auto Science儀器有限公司）、水分測定儀（MA35型，Sartorius AG Germany）、永磁旋轉(zhuǎn)攪拌反應(yīng)釜（GCF-1L20/350型，大連自控設(shè)備廠）、電子天平（AL240型，Mettler-Toledo儀器上海有限公司）、離心機（5425YH023096型，Eppendorf AG Hamburg Germany）、電熱恒溫鼓風干燥箱（101-2A型，上海東新建材實驗設(shè)備有限公司）、振蕩培養(yǎng)箱（ZHY-111型，上海智誠分析儀器制造有限公司）、干式恒溫器（GL-150B型，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）、高效液相色譜儀（1200 Series型，Agilent Technologies）、色譜柱（HPX-87H型，Bio-Rad公司）。

試驗中需要用到的主要化學(xué)試劑有：99%液氨（浙江杭州龍山化工有限公司）、98%硫酸（浙江杭州明星化工有限公司）、30%過氧化氫溶液（江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司）、檸檬酸（Sigma-aldrich（上海）貿(mào)易有限公司）以上四種試劑皆為分析純;還有標準品：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖（Sigma-aldrich（上海）貿(mào)易有限公司）;以及纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶（諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司）。

1.3? ? ?實驗方法

實驗原材料通過LAT預(yù)處理或HP-LAT預(yù)處理，將預(yù)處理后的材料進行酶解，分別在24h、72h、144h時對酶解液取樣，利用高性能液相色譜技術(shù)（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測各樣品中各類單糖的含量，并計算葡聚糖與木聚糖的轉(zhuǎn)化率。參考彭合歡[10]的研究，本實驗采用的工藝參數(shù)為：過氧化氫用量比：5：3，氨用量：2.0，預(yù)處理溫度：130℃，反應(yīng)時間：10min，固液比：4：3。下面依次介紹各個工藝步驟。

1.3.1? ? ?LAT預(yù)處理

在20g干基原料中加去離子水使其達到4：3的固液比，并將其攪拌均勻，然后放入反應(yīng)釜并密封。隨后將40g液氨注入反應(yīng)釜中，開始加熱至反應(yīng)釜溫度達到130℃，然后保溫10min。打開反應(yīng)釜的開口將氨氣緩慢放出，隨后將處理后的材料取出，放入通風使原料中的氨充分溢出。再將原料烘干，測其重量及含水率，并計算此反應(yīng)的損失率[11，12]。

（1）

式中：S—損失率;

g—反應(yīng)后材料的重量;

c—反應(yīng)后材料含的水率。

1.3.2? ? ?HP-LAT預(yù)處理

HP-LAT工藝流程的具體步驟：先根據(jù)5：3過氧化氫用量比根據(jù)在20g干基原料中加入過氧化氫，攪拌均勻，隨后根據(jù)LAT預(yù)處理的實驗方法進行實驗。

1.3.3? ? ?酶水解

將酶解溶液的量設(shè)定為15mL，精確稱取0.15g當量葡萄糖的預(yù)處理材料，放入酶解瓶中，并加入相應(yīng)量的蒸餾水，再依次加入0.75mL檸檬酸鈉緩沖液及0.045mL抗生素，在50℃恒溫箱中保存1h。然后往瓶中依次添加0.038mL纖維素酶，0.048mLβ-葡萄糖苷酶和0.015mL木聚糖酶。放入振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)置溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為150r/min[13-14]。

1.3.4? ? ?取樣

在酶解反應(yīng)時長為24h、72h和144h時各取1次樣。取1mL酶解樣品放入離心管中，先將離心管在干式恒溫器中加熱至99℃保持20min，然后將此離心管冷卻5min，使酶解液中的酶失去活性。繼而把離心管放入離心機中轉(zhuǎn)速15000rpm離心5min。然后將酶解液過濾，加入到HPLC樣品瓶中。

1.3.5? ? ?HPLC分析

使用高效液相色譜儀對樣品進行HPLC分析。流動相：稀硫酸（0.005mol/L）;流速：0.5ml/min;柱溫：50℃;進樣量：15μL;樣品測試時間：15min。

1.3.6? ? ?酸解

通過對4種原料材料的酸解處理可求出各原料中葡聚糖和木聚糖的含量。處理過程如下：取干質(zhì)為0.3g的木質(zhì)纖維素原料，隨后加入3mL的濃硫酸;將其放在30℃的水浴中2h，隨后加入去離子水84mL。然后將樣品放入121℃的滅菌鍋中停留1h，將樣品取樣后進行HPLC分析得出各樣品中各類單糖的峰面積。根據(jù)如下公式可計算出原材料中葡聚糖與木聚糖的百分含量[10]。

葡聚糖的含量計算公式為：

（2）

式中? ? ? Cg—葡聚糖的質(zhì)量濃度

Vg—葡聚糖的質(zhì)量分數(shù)

木聚糖的含量計算公式為：

（3）

式中? ? ? Cx—木聚糖的質(zhì)量濃度

Vx—木聚糖的質(zhì)量分數(shù)

1.4? ? ?數(shù)據(jù)處理

通過HPLC分析可得出各溶液的色譜圖，葡萄糖的出峰時間約為10.649，木聚糖的出峰時間約為11.368，阿拉伯糖的出峰時間約為12.491，取各糖的峰值數(shù)據(jù)，先計算單糖含量[11]。

E=A/L

式中? ?E—單糖含量;

A—峰面積;

L—由標準品經(jīng)線性化后得出的斜率。

再按照下列公式計算各類聚糖的酶解率。

葡聚糖酶解率公式：

（4）

式中：dg—葡聚糖酶解率;

Eg—葡聚糖糖含量;

Vg—葡聚糖的質(zhì)量分數(shù)。

木聚糖酶解率公式：

（5）

式中：dx—木聚糖酶解率;

Ex—木聚糖糖含量;

Vx—木聚糖的質(zhì)量分數(shù)。

1.5? ? ?超景深顯微分析

將未經(jīng)預(yù)處理，經(jīng)過LAT預(yù)處理，經(jīng)過HP-LAT預(yù)處理的材料粘貼在載玻片上，用超景深顯微系統(tǒng)進行觀測（50～5000倍），對比個材料預(yù)處理前后的微觀表面。

1.6? ? ?紅外光譜分析

取分別經(jīng)過無預(yù)處理、LAT預(yù)處理與HP-LAT預(yù)處理的4種材料少許，加入KBr混合后碾壓，制成壓片，利用Shimadzu IR Prestige-21進行測試，實驗條件為：光譜范圍0～4500cm-1，分辨率4cm-1。

2? ? ?實驗結(jié)果與分析

2.1? ? ?組分分析

根據(jù)酸解結(jié)果可測出原材料中各成分的含量，如表1所示。

2.2? ? ?不進行預(yù)處理條件下糖的轉(zhuǎn)化率

沒有預(yù)處理時4種原材料各類糖的轉(zhuǎn)化率如圖2所示。芒、楊木、玉米秸稈、竹子在酶解144h的葡聚糖酶解率依次為：28.65%、28.49%、28.79%、26.99%;木聚糖酶解率依次為：30.99%、27.81%、28.00%、26.34%?？芍贿M行預(yù)處理的4種木質(zhì)纖維素原料直接酶解，各類聚糖酶解率都較低，而且不同種類的木質(zhì)纖維素原料的聚糖酶解率相差不大[15]。

2.3? ? ?在LAT預(yù)處理條件下糖的轉(zhuǎn)化率

在LAT預(yù)處理條件下4種原材料各類糖的轉(zhuǎn)化率如圖3所示。在酶解144h之后芒、楊木、玉米秸稈、竹子的葡聚糖酶解率依次為：64.84%、55.14%、62.86%、48.83%;木聚糖酶解率依次為：69.59%、65.98%、66.96%、60.36%。可發(fā)現(xiàn)LAT預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素原料聚糖酶解率比沒有經(jīng)過預(yù)處理材料的聚糖酶解率有明顯的提高[16-17]。

2.4? ? ?在HP-LAT預(yù)處理條件下糖的轉(zhuǎn)化率

在HP-LAT預(yù)處理條件下，4種材料各類糖的轉(zhuǎn)化率如圖3所示。酶解144h后，芒、楊木、玉米秸稈、竹子的葡聚糖酶解率依次為：85.15%、64.59%、82.65%、57.70%;木聚糖酶解率依次為：85.73%、69.07%、82.71%、62.78%。將其與LAT預(yù)處理的聚糖酶解率相比較，HP-LAT預(yù)處理后的聚糖酶解率比LAT預(yù)處理的聚糖酶解率又有10%左右的提高[18-19]。

2.5? ? ?預(yù)處理對物理結(jié)構(gòu)的影響

通過對各預(yù)處理產(chǎn)物的顯微圖像分析后表明：未經(jīng)過預(yù)處理的原料表面光滑，細胞排列整齊;經(jīng)過LAT預(yù)處理的原料表面變得粗糙，蠟質(zhì)層略有翹起;經(jīng)過HP-LAT預(yù)處理的原料纖維結(jié)構(gòu)和細胞壁受到了極大的破壞，酶解的可及性大大提高。

2.6? ? ?預(yù)處理對化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

4種材料分別經(jīng)過LAT預(yù)處理、HP-LAT預(yù)處理以及無預(yù)處理的紅外光譜圖如圖5所示，對其中的一些特征譜峰進行分析[20，22]。

波數(shù)為1050cm-1的譜峰是纖維素、半纖維素一級和二級醇的振動特征峰。通過3條曲線的對比可發(fā)現(xiàn)：HP-LAT預(yù)處理后的吸光度最低，且吸收區(qū)域增大。波數(shù)為1250cm-1的譜峰是半纖維素C-O伸縮振動。由圖可見，經(jīng)過HP-LAT預(yù)處理后此峰基本消失。波數(shù)為1515cm-1和1650cm-1的譜峰為木質(zhì)素振動吸收特征峰。仔細觀察發(fā)現(xiàn)在1515cm-1處附近的許多小型波峰經(jīng)過預(yù)處理后基本消失;在1650cm-1處的波峰經(jīng)過預(yù)處理后吸收峰強度減弱，并有分峰現(xiàn)象出現(xiàn)。波數(shù)為2920cm-1的譜峰是木質(zhì)素側(cè)鏈中甲基、亞甲基和次甲基的C-H伸縮振動。經(jīng)對比可發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過預(yù)處理后峰值明顯下降。波數(shù)為3420cm-1的譜峰是木質(zhì)纖維素內(nèi)羥基O-H伸縮振動。通過對比發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理后的峰值降低，吸收峰強度加強，吸收峰區(qū)域增大。

通過紅外光譜分析可知，預(yù)處理可以打斷纖維素中的脂鍵與氫鍵，使甲基、亞甲基和次甲基基團斷裂，并破壞木質(zhì)素內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)，從而使酶解效率提高，而且HP-LAT預(yù)處理的破壞效果比LAT預(yù)處理的效果好。

4種材料在上述各波數(shù)時都有相同的譜峰特征，說明4種木質(zhì)纖維素材料的鏈接鍵、基團的種類都大致相同，但是各類材料譜峰的值和特征又有細微差異，這說明這4種木質(zhì)纖維素材料內(nèi)部的鏈接鍵、基團的數(shù)量、內(nèi)部結(jié)構(gòu)不完全相同，這也是各類材料酶解效率有差異的原因。

3? ? ?結(jié)論

根據(jù)4種木質(zhì)纖維素原料的產(chǎn)糖率分析可知：在不進行預(yù)處理的條件下，產(chǎn)糖率最低;在LAT預(yù)處理條件下，產(chǎn)糖率有明顯提升，其與不進行預(yù)處理相比產(chǎn)糖率提高了100%～120%;在HP-LAT預(yù)處理條件下，產(chǎn)糖率最高，其與LAT預(yù)處理條件相比產(chǎn)糖率又提高了10%～30%。

通過紅外色譜分析以及超景深顯微分析可知，得出此實驗結(jié)果的原因在于：HP-LAT預(yù)處理與其他2種條件相比，可以破壞更多材料內(nèi)部的脂鍵、氫鍵、甲基、亞甲基、次甲基基團以及木質(zhì)素，并且可以破壞大量纖維素與細胞壁，為酶的作用創(chuàng)造了更有利的條件。

在不進行預(yù)處理條件下，4種原料的糖轉(zhuǎn)化率沒有較大差別;而在有預(yù)處理條件下，芒的糖轉(zhuǎn)化率最高，依次是玉米秸稈、楊木、竹子。這是因為芒在經(jīng)過預(yù)處理后，內(nèi)部的鍵、基團以及木質(zhì)素的破壞程度最有利于酶解。

參考文獻

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