健脾化瘀方對肝癌HepG-2細(xì)胞生理活性的影響*

林泳欣，王昌俊

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000；2廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，目前對于肝癌的治療以手術(shù)為主，但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)70%。健脾化瘀方是導(dǎo)師根據(jù)“脾氣虧虛，瘀血內(nèi)結(jié)”理論結(jié)合名老中醫(yī)錢伯文教授的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，具有健脾益胃、化瘀散結(jié)等功效［1］。長期臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)研究［2-7］證明健脾化瘀方對肝癌有著良好的治療效果。本研究主要觀察健脾化瘀方對HepG-2細(xì)胞的侵襲力、轉(zhuǎn)移和凋亡的干預(yù)作用，為健脾化瘀方治療肝癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人源肝癌細(xì)胞株HepG-2由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶病研究所惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 健脾化瘀方(莪術(shù)12g，白術(shù)20g，茯苓20 g，苦參12 g，佛手12 g，白花蛇舌草15 g)購于廣東省人民醫(yī)院。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰酶均購于Gibco公司(美國)；青霉素G和鏈霉素、二甲基亞砜購于Sigma公司(美國)；CCK-8試劑盒購于jindo公司(日本)；TritonX-100購于Sanland化學(xué)公司；蘇木素、伊紅染液購于廣州維伯鑫科技有限公司等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內(nèi)常規(guī)單層傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 藥物提取與配制 用電熱套加熱回流提取法，按比例取生藥910 g，加入10倍純凈水中浸泡 30分鐘后，90～100℃提取 3次，1.5 h/次，冷凝管可回收莪術(shù)、白術(shù)、佛手揮發(fā)油。合并提取液，紗布過濾，合并2次濾液，混勻水溶性提取液與揮發(fā)油，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃濃縮至90 mL浸膏，再稀釋成不同濃度的藥液，存放于4℃冰箱中，抑菌備用。按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人(70 kg)與小鼠(0.020 kg)體表面積折算等效劑量比值為0.0026，換算后確定健脾化瘀方低、中、高劑量分別為6.24、12.48、24.96 g/kg。

1.4.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 健脾化瘀方的工作濃度為16 mg/mL。將生長至80%～90%的HepG-2細(xì)胞用胰酶消化，離心后落板，每孔加細(xì)胞懸浮液100 μL，邊緣空加 100 μL的 PBS避免邊緣效應(yīng)。24小時(shí)后用含不同濃度的含藥培養(yǎng)基或新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)液，每個(gè)濃度平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，留3個(gè)孔不加細(xì)胞懸液做空白對照，3個(gè)孔加細(xì)胞懸液不加藥物做陰性對照。接著將培養(yǎng)細(xì)胞放入培養(yǎng)箱孵育48、72小時(shí)。將96孔板取出，用新鮮培養(yǎng)基更換所有舊培養(yǎng)基，每孔加10 μL的CCK-8。再將96孔板孵育2小時(shí)在450 nm的熒光下讀取OD(optical density)值。該實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，得平均值用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

1.4.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell) 1)待對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞長滿瓶底80%后換無血清DMEM培養(yǎng)液饑餓8小時(shí)。2)調(diào)整HepG-2細(xì)胞密度為3.0×105個(gè)/mL，將transwell小室放入24孔板中，在transwell上室內(nèi)加入50 μL細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)液配制對應(yīng)健脾化瘀方藥物組(按照CCK-8算出的IC50濃度)濃度藥物，每上室分別加入50 μL含相同藥物濃度培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在transwell下室加入含30%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液各 600 μL，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)。3)將transwell小室取出，用棉棒將膜上表面未遷移的細(xì)胞小心擦去，下表面用10%甲醛固定30分鐘，PBS漂洗后蘇木素染色20分鐘，PBS漂洗至無色。4)在倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)、拍照。

1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 1)取對數(shù)生長期HepG-2細(xì)胞離心，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為每毫升2×106個(gè)，將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶5 mL。實(shí)驗(yàn)分為：陰性對照組、健脾化瘀方藥物組。按實(shí)驗(yàn)分組加入5 mL相應(yīng)濃度的藥物工作液(健脾化瘀方藥物組濃度按照CCK-8計(jì)算得出的IC50濃度為準(zhǔn))，混勻后置37℃5%CO2、飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后，收集細(xì)胞，1 000 rpm/min，離心5分鐘，棄上清，4℃PBS洗2次，再加入250 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106個(gè)/mL。2)將細(xì)胞培養(yǎng)液吸至合適的離心管中，PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，膜酶消化細(xì)胞(胰酶不含EGTA)，加入吸出的DMEM培養(yǎng)基中止消化。吹打下所有的貼壁細(xì)胞，吹散，收集至離心管。1 000 rpm離心5分鐘。3)吸除上清，加入PBS重懸，再次l OOO rpm離心5分鐘。4)棄上清，加1 mL冰浴預(yù)冷70%乙醇，吹打混勻，4℃固定2小時(shí)，l 000 rpm離心5分鐘。加1 mLPBS，重懸細(xì)胞，再次離心，吸除上清。5)加入0.5 mL碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，37℃避光溫浴30分鐘。6)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以(±s)表示，兩樣本均數(shù)間比較采用獨(dú)立分組t檢驗(yàn)，多組之間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健脾化瘀方對細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的健脾化瘀方作用于HepG-2細(xì)胞48、72小時(shí)后，根據(jù)回歸線性方程檢測，得出48小時(shí)藥物作用的IC50為12.15，72小時(shí)的IC50為9.75，且對于HepG-2細(xì)胞的抑制率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，HepG-2細(xì)胞和LO2肝細(xì)胞在作用72小時(shí)的IC50(半抑制濃度)上更加接近，故可選擇健脾化瘀方作用72小時(shí)的IC50濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度，見表1。

表1 不同濃度健脾化瘀方作用48及72小時(shí)對細(xì)胞 HepG-2 增值的影響(±s，n=3)

表1 不同濃度健脾化瘀方作用48及72小時(shí)對細(xì)胞 HepG-2 增值的影響(±s，n=3)

注：對48小時(shí)與72小時(shí)2組不同藥物濃度，采用回歸線性方程檢驗(yàn)，得出半數(shù)抑制濃度(IC50)

組別 48 h 72 h濃度20 0.9642±0.0297 0.9870±0.0272濃度15 0.9112±0.0328 0.7172±0.0493濃度10 0.4525±0.0935 0.4422±0.0369濃度8 0.2656±0.0253 0.2927±0.0054濃度5 0.1997±0.0840 0.2147±0.0501濃度2.5 0.0960±0.0259 0.1857±0.0315濃度0 0.0000 0.0000 R2 0.951 0.988 F 38.478 160.680 P 0.002 0.000 IC50 12.15 9.75

2.2 健脾化瘀方對HepG-2細(xì)胞遷移的抑制作用 藥物作用24小時(shí)后，在倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇2個(gè)視野，進(jìn)行拍照，并通過Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示：與陰性對照組比較，健脾化瘀方藥物組遷移率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖 1、表 2。

圖1 健脾化瘀方對HepG-2細(xì)胞遷移抑制作用(×10)

表2 健脾化瘀方對HepG-2細(xì)胞遷移的抑制作用

2.3 健脾化瘀方對HepG-2細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用 與陰性對照組比較，健脾化瘀方有促進(jìn)HepG-2細(xì)胞凋亡的作用，見圖2、表3。

圖2 健脾化瘀方對HepG-2細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞

表3 健脾化瘀方對HepG-2細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用

3 討論

手術(shù)是肝癌的主要治療手段，根治性切除術(shù)后機(jī)體處于一種腫瘤休眠狀態(tài)，即體內(nèi)存在一些微量腫瘤細(xì)胞，在一定時(shí)間范圍內(nèi)沒有被消除而潛伏，隨著時(shí)間的推移及體內(nèi)外因素的刺激會(huì)促使腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［8］，而肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者死亡的最常見和最主要的原因，因此促進(jìn)術(shù)后休眠，預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移對于肝癌的治療尤為重要。對于肝癌術(shù)后患者，針對體內(nèi)潛伏著的微量腫瘤細(xì)胞，如果能有效控制甚至消除殘存微量癌細(xì)胞，就能保持腫瘤處于休眠狀態(tài)，延長生存期。癌細(xì)胞對機(jī)體產(chǎn)生傷害離不開其自身的增殖、侵襲、遷移的能力，若能抑制癌細(xì)胞以上能力，能在一定程度上延緩腫瘤對機(jī)體的侵害。研究顯示健脾化瘀方中的白花蛇舌草能通過促進(jìn)免疫因子的分泌增強(qiáng)免疫以消除腫瘤細(xì)胞［9］；莪術(shù)油能明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖［10］；苦參能增強(qiáng)對肝癌細(xì)胞增殖的抑制，促肝癌細(xì)胞凋亡［11］；茯苓多糖能增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答［12］等。本研究發(fā)現(xiàn)健脾化瘀方能有效抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移，降低侵襲能力，并能促使癌細(xì)胞凋亡，提示健脾化瘀方能有效減緩肝癌術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)，可能是通過對機(jī)體內(nèi)部殘存休眠腫瘤細(xì)胞的抑制增殖及遷移能力，促進(jìn)殘存腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而延緩腫瘤復(fù)發(fā)的進(jìn)程，延長休眠期，保證了一定的生存時(shí)間。