腦心通膠囊對小鼠后下肢急性缺血模型抗炎作用研究

張璐莎，陳 璐，李春曉，尤星宇，房志銳，宋 敏，Joel Wake Coffie， 張麗媛，王 虹

(天津中醫(yī)藥大學天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津市中藥藥理學重點實驗室，方劑學教育部重點實驗室，天津 301617)

外周動脈疾病(peripheral artery disease,PAD) 是由于動脈粥樣硬化導致周圍動脈閉塞或狹窄而引起的缺血性疾病。據(jù)估計，全世界有超過2 億人患有PAD，在老年人中發(fā)病尤其普遍，在55歲以上的人群中約有24%～32%患此病，患者運動能力明顯下降，甚至面臨截肢的危險，因此PAD是全球性的健康負擔[1-3]。PAD是一種復雜的具有損傷性炎癥反應的疾病，它包括激活免疫細胞的過度炎癥反應以及促炎性細胞因子的釋放，其將穩(wěn)定斑塊轉化為易損的不穩(wěn)定斑塊，進而加重肢體缺血損傷，越來越多的證據(jù)表明，炎癥在PAD的病理生理學中起到關鍵作用[4-5]。腦心通膠囊(Naoxintong capsule, NXT ) 由16味中藥組成，具有活血化瘀、行氣止痛之功效，是臨床應用的大復方，其中丹參、當歸、紅花、赤芍具有活血化瘀功效，黃芪具有補氣升陽、助血行氣之功效，多個成分協(xié)同作用，最大限度地發(fā)揮各自的藥理作用。NXT在臨床上廣泛應用于缺血性心腦血管疾病的治療及二級預防，取得良好療效，但其抗缺血組織損傷炎性反應機制尚不明確。本研究采用小鼠后下肢缺血(hind limb ischemia, HLI)模型，探討NXT對外周缺血組織炎癥反應的作用及其可能的作用機制。

1 材料

1.1實驗動物52只SPF級健康ICR小鼠，♂，體質量 ( 30±2 ) g，8 周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK (京) 2012-0001。實驗動物于天津市中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學放射工程研究所動物房中分籠飼養(yǎng)，自由進食，飼養(yǎng)溫度(22～25)℃，相對濕度40%～60% 。

1.2藥物與試劑NXT超微粉(陜西步長制藥有限公司)。三溴乙醇(avertin，美國Sigma)；流式抗體PE anti-F4/80、APC-Cy7 anti-Ly-6G、PerCP anti-CD45 (美國Becton, Dickinson and Company，貨號分別為565410、560600、561047)；0.9%氯化鈉注射液(山東科倫藥業(yè)有限公司)；實驗用水為去離子水；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (貨號：04897030001)、FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (貨號：04913914001)，均購自美國Roche公司。

1.3儀器體式顯微鏡LEICA S8APO(德國Leica公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；64R型低溫高速離心機(美國Beckman公司)；小動物手術器械包(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；COMPAC5小動物多功能麻醉機(美國VETEQUIP)；7500 Real-time PCR(美國Applied Biosystems)。

2 方法

2.1單側后肢缺血模型(hindlimbischemia,HLI)的建立根據(jù)文獻方法，建立小鼠單側后肢缺血模型。在腹部側面和腹股溝韌帶表面形成5 mm的橫向切口，以6/0號縫合線結扎動脈血管上下兩端，在結扎線之間橫切血管，縫合皮膚。術后血流量降低到術前的10%以下，且血流的頻譜發(fā)生明顯改變，以此作為后肢缺血模型成功建立的標準，然后將小鼠置于37℃電熱毯上直至蘇醒，不符合此標準的動物剔除。

2.2實驗分組與給藥按照隨機雙盲的方法，將動物分成3組：假手術組、模型組、給藥組(模型+NXT 700 mg·kg-1·d-1)，每組16～18只。術后1 h，假手術組與模型組灌胃生理鹽水0.01 mL·g-1，給藥組灌胃NXT，每天1次，3 d后取材。

2.3流式細胞術鑒定中性粒細胞和巨噬細胞參考文獻方法[6]，從小鼠腓腸肌中分離出白細胞，用相應的流式抗體標記后，采用流式細胞術檢測中性粒細胞、巨噬細胞的陽性比例。

2.4定量RT-PCR法檢測Emr1、TNF-α、IL-1βmRNA的表達使用TRIzol從小鼠腓腸肌中提取RNA，逆轉錄合成cDNA，使用FastStart Universal SYBR? Green Master (ROX) 進行qRT-PCR，檢測Emr1 (F4/80)、TNF-α、IL-1β的表達。F4/80正向引物: 5′-CTGCACCTGTAAACGAGGCTT-3′, 反向引物: 5′-TTGAAAGTTGGTTTGTCCATTGC-3′；TNF-α正向引物: 5′-AGAAACACAAGATGCTGGGACAGT-3′,反向引物: 5′-CCTTTGCAGAACTCAGGAATGG-3′; IL-1β正向引物: 5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′, 反向引物: 5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′。

2.5蛋白芯片檢測相關蛋白的變化依據(jù)蛋白芯片(R&D公司，貨號：ARY028)說明書，進行后續(xù)操作。

3 結果

3.1NXT對HLI小鼠腓腸肌組織中中性粒細胞數(shù)目的影響構建小鼠單側HLI損傷模型，術后d 3采用流式細胞術檢測腓腸肌中中性粒細胞的數(shù)量。用Cell Quest軟件建立獲取模板 FSC/SSC雙參數(shù)散點圖，設P1門選定腓腸肌組織中除細胞碎片外的所有細胞為目的細胞 (Fig 1A )。建立分析模板APC-Cy7-Ly6G/PE-F4/80熒光雙參數(shù)十字門散點圖，橫坐標代表PE-F4/80熒光強度，縱坐標代表APC-Cy7-Ly6G熒光強度，分析腓腸肌中中性粒細胞陽性細胞比例，中性粒細胞為表達Ly6G陽性、F4/80陰性的細胞，如Fig 1C Q1門所示。術后3 d(Fig 1B、1C)，與假手術組相比，模型組Ly6G+F4/80-細胞數(shù)量明顯上調 (P<0.01)；與模型組相比，NXT組Ly6G+F4/80-細胞數(shù)量明顯下調 (P<0.01)。結果提示，NXT在術后3 d時可以下調中性粒細胞的數(shù)量。

3.2NXT對HLI小鼠腓腸肌組織中巨噬細胞數(shù)目的影響術后d 3采用流式細胞術檢測腓腸肌中巨噬細胞的數(shù)量，同樣用Cell Quest軟件建立獲取模板FSC/SSC雙參數(shù)散點圖，設P1門選定腓腸肌組織中除細胞碎片外的所有細胞為目的細胞(Fig 2A)。再用該軟件建立分析模板PerCp-CD45/PE-F4/80熒光雙參數(shù)十字門散點圖，橫坐標代表PE-F4/80熒光強度，縱坐標代表PerCp-CD45熒光強度，分析腓腸肌中巨噬細胞陽性細胞比例，巨噬細胞為同時表達F4/80、CD45的雙陽性細胞，如Fig 2C中Q2-1所示。術后3 d，與假手術組相比，模型組CD45+F4/80+細胞數(shù)量明顯上調 (P<0.01)；與模型組相比，NXT組CD45+F4/80+細胞數(shù)量明顯下調 (P<0.01)，可知NXT在術后3 d時可以下調巨噬細胞的數(shù)量(Fig 2A-2C)。Emr1基因是指征巨噬細胞的標志性基因，術后3 d通過qPCR方法檢測腓腸肌中Emr1表達水平。結果顯示：與流式細胞術結果一致，術后3 d，與假手術組相比，模型組Emr1 mRNA表達明顯上調 (P<0.01)；與模型組相比，NXT組Emr1的表達明顯下調 (P<0.01) (Fig 2D)。以上結果表明，NXT在后下肢缺血后3 d時可以下調巨噬細胞的數(shù)量。

3.3NXT對炎癥信號通路中IL-1β、TNF-αmRNA表達的影響IL-1β、TNF-α是參與炎癥的主要細胞因子，本研究通過qPCR方法檢測NXT加藥處理后腓腸肌中IL-1β和TNF-α的表達水平。Fig 3結果顯示，術后3 d腓腸肌組織中，與假手術組相比，模型組IL-1β、TNF-α mRNA表達上調(P<0.05，P<0.01)；與模型組相比，NXT組IL-1β、TNF-α mRNA表達下調 (P<0.05，P<0.01)。 結果顯示，NXT可以下調IL-1β、TNF-α的基因轉錄水平。

3.4NXT對炎癥相關蛋白表達的影響為了進一步闡釋NXT抗炎的作用機制，術后d 3取手術側腓腸肌組織進行組織蛋白提取，利用小鼠細胞因子陣列試劑盒 (Proteome ProflerTMArray )進行檢測。如Fig 4所示，F(xiàn)ig 4A黑色框中顯示NXT給藥后表達上調的蛋白，與模型組相比，NXT組表達上調的蛋白有CCL17、CCL22、白介素1受體拮抗劑(interleukin 1 receptor antagonist，IL-1ra)、IL-4、IL-13、IL-10，量化圖見Fig 4B。其中，CCL17與CCL22是M2a型巨噬細胞的標志物[7-8]，IL-4誘導巨噬細胞向M2a型轉化，M2a型巨噬細胞促進組織修復或組織重塑[9]。提示NXT治療后，M2a型巨噬細胞的表達量較模型組增多可能與IL-4、CCL17、CCL22表達量增多有關。

Fig 1 Effect of NXT on neutrophil inhibition 3 d after HLI injury n=5～6)

Fig 4C黑色框顯示NXT給藥后表達下調的蛋白，與模型組相比，NXT組表達下調的蛋白7個，量化圖見Fig 4D。其中，CCL5、CXCL9蛋白是M1促炎型巨噬細胞的生物標志[8]，參與調控白細胞的趨化活性及炎性反應等各種生理功能，TNF-α是體內(nèi)重要的炎性因子，參與M1型巨噬細胞的轉化[10]。NXT治療后，CCL5、CXCL9、TNF-α等的表達量下降，提示NXT組M1巨噬細胞較模型組表達量降低。

3.5差異表達蛋白的生物信息學分析進一步對蛋白芯片結果進行分析，應用panther和string查詢差異蛋白的功能及相互關系。Fig 5A顯示差異蛋白所涉及到的信號通路主要有介導炎癥的趨化因子和細胞因子信號通路、白介素信號通路，這些通路可能參與NXT抗炎藥理作用的過程，同時提示NXT抗炎的作用機制可能與趨化因子和細胞因子信號通路介導的炎癥反應相關。為了進一步研究蛋白之間的相互關系，通過string分析上調和下調的差異蛋白相互作用網(wǎng)絡。結果顯示：NXT加藥處理后，表達上調的蛋白相互作用包括細胞因子-細胞因子受體之間的相互作用，以及IL-4、IL-13調節(jié)巨噬細胞的激活，即調節(jié)M2a的激活，如Fig 5B所示；NXT加藥處理后，表達下調的蛋白相互作用包括參與炎癥反應以及調節(jié)細胞分化，如Fig 5C所示，經(jīng)過查閱文獻，其中介導細胞分化的CCL5、CXCL9、IL-5、TNF-α參與M1型巨噬細胞的表達與募集。差異蛋白參與的通路以及相互作用進一步表明，與模型組相比，NXT組抗炎作用可能與M1型巨噬細胞表達減少，M2a型巨噬細胞增多有關。

Fig 2 Effect of NXT on macrophage inhibition 3 d after HLI injury n=5～6)

Fig 3 Expression of IL-1β and TNF-α mRNA in skeletal muscles down-regulated by NXT n=3)

4 討論

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，NXT可以減少中性粒細胞以及巨噬細胞在損傷部位的積累，降低巨噬細胞標志性基因Emr1的表達，降低炎性因子TNF-α、IL-1β的表達，提示NXT能夠降低缺血后肢的炎性損傷，為后續(xù)組織修復提供良好的微環(huán)境。蛋白芯片結果提示，NXT在后下肢缺血模型中降低炎癥反應，可能是通過調節(jié)CCL5、CXCL9、IL-4、CCL17、CCL22等上下游蛋白，介導M1型巨噬細胞向M2a型巨噬細胞之間的轉變來實現(xiàn)，后期本課題組將對以上假說進行進一步實驗驗證。

從炎癥消退到組織修復的過渡階段，炎性介質可能會隨著血運重建，繼續(xù)參與后續(xù)的修復反應。慢性炎癥是血運重建中的關鍵障礙，其在外周動脈疾病中損害內(nèi)源性血管再形成，并限制血運重建治療的有效性，一些炎癥介質的參與導致臨床上治療外周動脈疾病效果不佳[11]。由此可見，炎癥與缺血性疾病有重要聯(lián)系。

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，NXT可以降低損傷部位中性粒細胞的募集，當創(chuàng)傷發(fā)生后，最先到達炎癥部位的有核細胞是中性粒細胞，中性粒細胞滲出血管并聚集到損傷部位，可通過釋放細胞因子、蛋白水解酶等，引起機體正常組織的損傷，并可能延緩炎癥反應的解決過程。 Kyriakides等[12]結果證明，中性粒細胞在骨骼肌損傷后還可以導致肌肉二次損傷，不利于肌肉再生。在后肢缺血模型中，NXT可以降低位于損傷部位的中性粒細胞數(shù)量，提示NXT可以降低中性粒細胞參與的炎癥反應的發(fā)生。

Fig 4 Effect of NXT on related proteins 3 d after HLI injury (n=3)

同時發(fā)現(xiàn)NXT可以降低損傷部位巨噬細胞的募集，以及降低巨噬細胞的標志性基因Emr1的表達。研究顯示[13]，巨噬細胞比率在傷后6～12 h，保持在較穩(wěn)定的低水平，傷后1 d時迅速升高達到高峰值，傷后3 d急劇減少，但仍顯示占有極少量的比率。如果巨噬細胞在損傷部位持續(xù)積累將會導致局部持續(xù)的炎癥，組織損傷進一步加重，創(chuàng)傷修復就會明顯延遲，甚至無法完成修復。Emr1(F4/80)基因是單核細胞從血液到達創(chuàng)傷部位獲得的屬于巨噬細胞的一種表型。本實驗結果表明，在經(jīng)歷后肢缺血模型3 d時，NXT可以降低巨噬細胞在損傷部位的數(shù)量，降低巨噬細胞的標志性基因Emr1的表達，提示NXT可以降低巨噬細胞在損傷部位的積累，降低巨噬細胞參與的炎癥反應的發(fā)生。

NXT可以降低炎性因子TNF-α、IL-1β的表達。TNF-α、IL-1β由促炎型巨噬細胞分泌產(chǎn)生，TNF-α在許多炎癥性疾病中起關鍵作用；IL-1β是早期的促炎因子，IL-1β能夠促進內(nèi)皮細胞通透性的增加，刺激趨化因子的釋放和大量黏附分子的表達，導致單核細胞/巨噬細胞和中性粒細胞等炎癥細胞向缺血區(qū)域的募集，擴大炎癥反應導致進一步的損傷。本研究的蛋白芯片和qPCR結果共同表明，在后下肢缺血模型中，NXT可以降低TNF-α、IL-1β炎性因子的表達，提示NXT可以降低TNF-α、IL-1β參與的炎癥反應的發(fā)生。

研究結果提示，NXT在組織缺血后通過調節(jié)巨噬細胞表型轉變，抑制炎癥反應的發(fā)生，與Wang等[14]的報道一致。此外，通過蛋白芯片與生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，此轉變可能與IL-4、CCL17、CCL22、CCL5、CXCL9、TNF-α參與的信號通路相關。體內(nèi)M1與M2處于相對平衡的狀態(tài)，研究證實巨噬細胞的損傷主要是由炎性M1巨噬細胞導致的，而替代激活的M2巨噬細胞是組織修復或重塑階段晚期的主要影響因素[15]，M2巨噬細胞可分為M2a (IL-4/13激活型)、M2c (IL-10激活型)。綜合蛋白芯片以及蛋白之間相互關系結果，提示在小鼠后下肢缺血后3 d時，NXT抗炎作用可能是通過誘導M1巨噬細胞轉變向M2a型巨噬細胞來實現(xiàn)。

綜上所述，NXT可以通過抑制外周缺血組織促炎因子的產(chǎn)生，調節(jié)巨噬細胞表型轉化發(fā)揮抗炎作用，參與調節(jié)的蛋白包括CCL5、CXCL9、TNF-α、IL-4、CCL17、CCL22，涉及趨化因子和細胞因子調節(jié)信號通路。本研究證實NXT對于治療外周動脈疾病具有一定的應用前景，但其作用機制還有待于進一步探討。