炎寧糖漿抗炎活性及其作用機制研究

楊燕妮，王 毅，孫曉波，匡海學(xué)，姜 海，曹景文，王艷紅，劉恩臨，舒尊鵬,

(1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；3. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；4. 哈爾濱市康隆藥業(yè)有限責(zé)任公司，黑龍江 哈爾濱 150025)

炎寧糖漿(國藥準(zhǔn)字Z20090915)為哈爾濱市康隆藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的一味中成藥，收載于2015版《中國藥典》，由玄參科鹿茸草屬多年生草本植物鹿茸草MonochasmasheareriMaxim.ex Franch.、鴨跖草科鴨跖草屬多年生草本植物鴨跖草Commelinacommunis、茜草科耳草屬多年生草本植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld.三味中藥組成，具有清熱解毒、消炎止痢的功效，臨床上用于上呼吸道感染、扁桃體炎、尿路感染、急性菌痢、腸炎等多種炎癥型疾病[1-2]。

現(xiàn)代研究表明，鹿茸草具有抗炎、止咳作用[3]，其主要化學(xué)成分為苯乙醇苷類、黃酮類等[4]；鴨跖草具有抗炎[5]、鎮(zhèn)痛、止咳、抗氧化、抗流感病毒、保肝等藥理作用，含黃酮類、生物堿類、香豆素類、萜類、甾體等成分[2,6]；白花蛇舌草具有抗癌、抗氧化、抗炎等藥理作用，其主要化學(xué)成分為萜類、黃酮類、蒽醌類、多糖類等[7]?；谘讓幪菨{的抗炎系統(tǒng)藥效研究未見報道，本實驗分別在體內(nèi)及體外炎癥模型中，探討炎寧糖漿及其單味藥的抗炎作用及相關(guān)機制，旨在為炎寧糖漿的臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1實驗動物SPF級，ICR小鼠體質(zhì)量(20±2)g，SD大鼠體質(zhì)量(180±10)g，♀♂各半，由廣東藥科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號分別為SCXK(粵)20170029和SCXK(粵)20170119。所有小鼠和大鼠均分籠，并飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實驗動物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。飼養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃，相對濕度(45±5)%，光暗各12 h，自由進(jìn)食飲水。

1.2藥物與試劑

1.2.1藥物 炎寧糖漿組成所需的3種藥材由哈爾濱市康隆藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，并由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥資源系李書淵教授鑒定為：玄參科鹿茸草屬多年生草本植物鹿茸草(MonochasmasheareriMaxim. ex Franch.)，茜草科耳草屬多年生草本植物白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld.)，鴨跖草科鴨跖草屬多年生草本植物鴨跖草(Commelinacommunis)。樣本留存在廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院(樣品號分別為20170712A、20170712B和20170712C)。阿司匹林購自濟(jì)南永寧制藥股份有限公司，產(chǎn)品批號為170904。

1.2.2細(xì)胞株與試劑 人單核巨噬細(xì)胞株THP-1細(xì)胞，購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞所；10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；IκBα (6A920)、NF-κB p65 (C-20)、TBP (H-102)抗體，購自Santa Cruz公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS) (V1131)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)(L20)抗體，購自Bioworld公司；β-actin抗體購自博士德公司；內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)購自美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液購自美國Fluka公司；IL-6、IL-1β、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒，均購自南京凱基公司；一氧化氮(nitric oxide，NO)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)檢測試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所；BCA蛋白測定試劑盒購自美國Thermo公司。

1.3實驗儀器XS-402型生物顯微鏡(江南光電集團(tuán)股份有限公司)；FC全波長酶標(biāo)儀、Heracell VIOS二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司)；DYCP-31-34瓊脂糖水平電泳槽(北京六一儀器廠)；半干式轉(zhuǎn)膜槽(美國 Bio-Rad 公司)；Odyssey 近紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國 LI-COR 公司)。

2 實驗方法

2.1藥品制備按2015版《中國藥典》進(jìn)行藥品提取濃縮，即三味中藥按照鹿茸草、白花蛇舌草和鴨跖草2 ∶1 ∶1的比例(共200.0 g)，加水回流煎煮兩次，第1次煎煮1.5 h，第2次煎煮1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.10，加乙醇使含醇量達(dá)到60%，攪勻，靜置12 h，濾過，減壓揮干成粉(16.0 g，出膏率8.0%)。另取鹿茸草、白花蛇舌草、鴨跖草藥材各200 g，按上述方法制備，分別得到干粉11.8 g(出膏率5.90%)、16.4 g(出膏率8.20%)和17.9 g(8.95%)，用于后續(xù)實驗。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5% CO2培養(yǎng)條件下，使THP-1細(xì)胞懸浮生長于RPMI 1640培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、0.1 g·L-1鏈霉素和2 mmol·L-1L-谷氨酰胺)。根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，每2～3 d換液1次，采用半量換液或者離心重懸的方法，維持細(xì)胞生長濃度在1×108～1×109·L-1。

2.3MTT法檢測細(xì)胞活力將分散均勻的細(xì)胞懸液加入96孔板中，濃度為每孔105個細(xì)胞。將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日離心吸出培養(yǎng)液，加入6個濃度梯度的總提取物和3種單味藥提取物(分別為0.2、1、5、25、125、625 mg·L-1)，每孔100 μL，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。設(shè)置調(diào)零孔(0.1% DMSO的PBS液)、對照孔(MTT)和加藥孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。次日培養(yǎng)板高速離心，取出上清液后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，以MTT試劑盒中的溶解液溶解結(jié)晶。培養(yǎng)箱中放置過夜，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后，于570 nm測吸光度。調(diào)零孔的吸光度值設(shè)置為100%。

2.4ELISA測定細(xì)胞因子取對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋成約1×109·L-1濃度，接種于6孔板中，每孔2 mL，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，空白對照組和模型給藥組加入總提取物、鹿茸草和鴨跖草(25 mg·L-1)孵育12 h，隨后，模型組和模型給藥組分別加入LPS(1 mg·L-1)，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，連續(xù)孵育24 h。收集培養(yǎng)24 h后的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒的說明書操作，在450 nm波長(630 nm作為參考波長)檢測吸光度(OD)值，檢測總提取物、鹿茸草和鴨跖草對LPS誘導(dǎo)分化的THP-1細(xì)胞因子分泌的影響。

2.5Westernblot檢測細(xì)胞處理同“2.4”，應(yīng)用含蛋白酶抑制劑PMSF及磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液RIPA提取LPS及總提取物(25 mg·L-1)培養(yǎng)6 h后，THP-1細(xì)胞的總蛋白，100℃煮沸5 min，使蛋白充分變性。BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h；TBST洗膜后，用TBST稀釋的一抗(1 ∶200)4℃孵育過夜；TBST再次洗膜后，TBST稀釋的HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1.5 h；最后應(yīng)用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，并根據(jù)目的條帶亮度調(diào)整壓片及曝光時間。

2.6小鼠耳腫脹實驗取健康ICR小鼠，♀♂各半，按體質(zhì)量隨機分為5組，每組10只小鼠，即模型組、炎寧高劑量組(300.0 mg·kg-1，相當(dāng)于炎寧生藥6.0 g·kg-1)、炎寧中劑量組(150.0 mg·kg-1，相當(dāng)于炎寧生藥3.0 g·kg-1)、炎寧低劑量組(75.0 mg·kg-1，相當(dāng)于炎寧生藥1.5 g·kg-1)和陽性對照組(阿司匹林200.0 mg·kg-1)。各組均灌胃給藥連續(xù)7 d，空白組給予同體積生理鹽水，實驗前小鼠禁食不禁水18 h，最后一次給藥后30 min，在小鼠的右耳正反兩面均勻涂二甲苯0.1 mL，2 h后脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用6 mm打孔器在左、右耳相同部位打孔稱重，記錄腫脹度，右耳重量減去左耳重量即為腫脹度。

耳腫脹抑制率/%=

2.7大鼠足腫脹測定取健康SD大鼠，♀♂各半，按體質(zhì)量隨機分為5組，每組10只大鼠，即模型組、炎寧高劑量組(180.0 mg·kg-1，相當(dāng)于炎寧生藥2.25 g·kg-1)、炎寧中劑量組(90.0 mg·kg-1，相當(dāng)于炎寧生藥1.125 g·kg-1)、炎寧低劑量組(45.0 mg·kg-1，相當(dāng)于炎寧生藥0.5625 g·kg-1)和陽性對照組(氫化可的松注射液0.25 mg·kg-1)。各組均灌胃給藥，空白組給同體積生理鹽水，連續(xù)7 d，致炎劑為10%的新鮮蛋清。d 7實驗前大鼠禁食不禁水18 h，將大鼠右后肢固定，在其踝關(guān)節(jié)處用記號筆作一標(biāo)記，沒過標(biāo)記為界，測右后肢正常足體積，連續(xù)測量3次，取平均值，然后灌胃給藥(陽性組腹腔注射)，給藥1 h后，右后肢足趾中部皮下注射10%新鮮蛋清0.1 mL，分別在注入致炎劑后1、2、3、4 h測足體積。

3 結(jié)果

3.1不同濃度總提取物及3個單味藥對免疫細(xì)胞活力的影響如Fig 1所示，分別將總提取物及3個單味藥與免疫細(xì)胞THP-1預(yù)孵育24 h后，鹿茸草和鴨跖草分別在最大濃度(625 mg·L-1)下對正常免疫細(xì)胞的增殖均無明顯的抑制作用(P>0.05)，而總提取物在125 mg·L-1及白花蛇舌草在5 mg·L-1以上的濃度，表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖現(xiàn)象，即細(xì)胞毒活性。

Fig 1 Cytotoxicity test in THP-1 n=6 )

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.2對LPS誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞中NO、PGE2釋放及iNOS、COX-2表達(dá)的抑制作用如Fig 2所示，在THP-1細(xì)胞中，總提取物、鹿茸草和鴨跖草單獨孵育THP-1細(xì)胞時，PGE2均未有變化；但在NO含量的檢測中，發(fā)現(xiàn)鹿茸草顯示出抑制NO生成的作用。LPS刺激后，總提取物、鹿茸草和鴨跖草均可降低NO和PGE2的釋放。Fig 3結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞后，iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)明顯升高，而給藥組蛋白表達(dá)則明顯降低。這些結(jié)果說明，總提取物、鹿茸草和鴨跖草均可減少LPS誘導(dǎo)的NO和PGE2的分泌，其作用機制主要是通過減低iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)來實現(xiàn)的。

3.3對LPS誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的抑制作用如Fig 4所示，在THP-1細(xì)胞中，空白對照組細(xì)胞因子水平處于較低的水平，單獨給予總提取物(25 mg·L-1)時，THP-1細(xì)胞并未見細(xì)胞因子分泌量的明顯改變，但單獨給予鹿茸草和鴨跖草時，細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，與之前的NO生成結(jié)果幾乎一致。進(jìn)一步研究證實鹿茸草和鴨跖草是否具有免疫抑制活性。經(jīng)LPS孵育，THP-1細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯增加，與空白對照組相比有明顯差異(P<0.01)，而加入總提取物、鹿茸草和鴨跖草孵育后，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均明顯降低(P<0.01)。

Fig 2 Inhibitory effects on PGE2(A) and NO(B) releases in LPS-stimulated THP-1 n=6 )

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLPS group

Fig 3 Total cellular protein isolated and LPS-induced iNOS and COX-2 expression levels measured using Western blot analysis n=3)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsLPS group

Fig 4 Inhibitory effects on TNF-α(A), IL-1β (B) and IL-6(C) releases in LPS-stimulated THP-1 cells n=6 )

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLPS group

3.4總提取物對LPS誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞中NF-κB通路的影響如Fig 5所示，各組間IκBα總蛋白表達(dá)差異無顯著性。LPS刺激后，THP-1細(xì)胞中p-IκBα蛋白表達(dá)較對照組明顯升高；總提取物處理后，p-IκBα蛋白表達(dá)與LPS組比較明顯降低。此結(jié)果說明，總提取物對LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中IκBα磷酸化蛋白的升高具有抑制作用。LPS誘導(dǎo)后，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)出現(xiàn)差異。當(dāng)總提取物處理時，其可明顯降低LPS誘導(dǎo)的NF-κB的核轉(zhuǎn)位。此結(jié)果說明，總提取物可能通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而抑制細(xì)胞因子的表達(dá)。

Fig 5 Inhibitory effects of total extract on NF-κB signaling in LPS-stimulated THP-1 n=3)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLPS group

3.5對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響Tab 1結(jié)果表明，與模型組比較，阿司匹林組和炎寧高劑量組對二甲苯引起小鼠耳腫脹有很強的抑制作用(P<0.01)，炎寧中、低劑量組也可抑制小鼠耳腫脹(P<0.05)，提示炎寧高、中、低劑量組均能減輕炎癥早期導(dǎo)致的毛細(xì)血管擴張、滲出和水腫等作用。

3.6對蛋清引起的大鼠足腫脹的影響Tab 2結(jié)果表明，給予致炎劑前，各組之間的正常足體積差異無顯著性(P>0.05)。給予致炎劑后，各給藥組在不同時間段分別同模型組相比，氫化可的松組在2 h以內(nèi)均有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，但隨著時間的延長，消腫作用有所下降。同樣，炎寧高、中劑量組在致炎后2 h之內(nèi)也表現(xiàn)出差異有顯著性(P<0.05)，炎寧低劑量組在致炎后差異無顯著性(P>0.05)。

Tab 1 Effects of Yanning syrup on ear swelling of mice induced by xylene n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

4 討論

炎寧糖漿因其組方獨特、療效確切、副作用小而被列為國家中藥保護(hù)品種[2]，3種單味藥鹿茸草、鴨跖草和白花蛇舌草從古至今各家醫(yī)書也均有記載，如《湖南藥物志》記載：“鹿茸草四錢，水煎兌冰糖服治咳嗽”，《袖珍方》曰：“鴨跖草汁點之可治喉痹腫痛”，白花蛇舌草始載于《廣西中藥志》：“治小兒疳積，毒蛇咬傷，癌腫，外治白泡瘡，蛇癩瘡”。在本文中，通過觀察二甲苯致小鼠耳腫脹和雞蛋清致大鼠足腫脹兩個經(jīng)典實驗，發(fā)現(xiàn)炎寧糖漿總提取物對急性或炎癥早期的毛細(xì)血管擴張、通透性亢進(jìn)、滲出和水腫具有明顯的抑制作用。此外，體外實驗中發(fā)現(xiàn)鹿茸草和鴨跖草對正常免疫細(xì)胞的增殖均無明顯的抑制作用，說明鹿茸草和鴨跖草發(fā)揮抗炎作用并非源于免疫細(xì)胞的減少，而是出于對免疫通路的調(diào)控。本實驗中，白花蛇舌草在5 mg·L-1以上表現(xiàn)出細(xì)胞毒現(xiàn)象，與文獻(xiàn)記載白花蛇舌草(12.5 mg·L-1)作用48 h[8]，出現(xiàn)明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的作用所得的結(jié)果相一致，推測白花蛇舌草可導(dǎo)致相應(yīng)細(xì)胞的凋亡[9]，抑制細(xì)胞增殖。因其具有細(xì)胞毒活性，未繼續(xù)進(jìn)行體外抗炎作用研究?？偺崛∥镌诖鬂舛认乱渤霈F(xiàn)細(xì)胞毒現(xiàn)象，其原因可能為隨著白花蛇舌草濃度的加大，從而出現(xiàn)細(xì)胞毒現(xiàn)象。

在正常的生理環(huán)境下，由免疫細(xì)胞所釋放的與炎癥相關(guān)的炎性介質(zhì)，如NO、PGE2等，主要用于組織的保護(hù)與修復(fù)，而他們的過度表達(dá)則會造成免疫損傷，加重病情。當(dāng)機體受到損傷或病原體入侵時，免疫系統(tǒng)激活并招募大量炎癥細(xì)胞浸潤，分泌多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生[10]。炎癥是機體對于傷害性刺激、組織損傷以及感染等多種誘導(dǎo)因素所做出的級聯(lián)應(yīng)激反饋。如LPS刺激后，免疫細(xì)胞能夠分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等多種細(xì)胞因子[11-12]，這些細(xì)胞因子可造成機體炎癥的過度表達(dá)。因此，NO和PGE2在免疫系統(tǒng)里作為典型的炎性介質(zhì)，常用于檢測免疫細(xì)胞是否被激活，而iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)可對細(xì)胞中NO和PGE2的合成起到關(guān)鍵作用。本實驗檢測了總提取物、鹿茸草和鴨跖草對LPS誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞活化后，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的變化，同時選定NO和PGE2作為考察指標(biāo)，并通過Western blot技術(shù)檢測iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步驗證。實驗結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)免疫細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中NO、PGE2、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明顯升高；通過總提取物、鹿茸草和鴨跖草處理則可降低其在上清液中的表達(dá)。總提取物、鹿茸草和鴨跖草可明顯降低LPS誘導(dǎo)的iNOS和COX-2蛋白水平，而起到抑制NO和PGE2分泌作用。

Tab 2 Effects of Yanning syrup on swelling of mice hind paw induced by fresh egg white n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

NF-κB廣泛存在于真核細(xì)胞中，是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。已有的大量報道表明，NF-κB通路在LPS誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化過程中起著重要作用[12]。在哺乳動物細(xì)胞中，NF-κB蛋白家族主要包括NF-κB 1(p50)、NF-κB 2(p52)、RelA (p65)、RelB和c-Rel 5個成員[13]。在正常靜息狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)NF-κB通常以無活性的三聚體或有活性的二聚體存在。當(dāng)細(xì)胞受到LPS、細(xì)胞因子、病毒等刺激時，IκBα發(fā)生磷酸化[14]，隨之又發(fā)生泛素化，其構(gòu)象發(fā)生改變后，從而釋放出NF-κB二聚體，使其得以轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核中，特異性地與DNA上相應(yīng)靶基因調(diào)控元件的序列相結(jié)合，單獨作用或與其他轉(zhuǎn)錄因子共同影響，上調(diào)這些靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮相應(yīng)的生理及病理作用。本文實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后，p-IκBα的蛋白水平明顯升高，總提取物則可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。此外，對于核內(nèi)的NF-κB的檢測也可看出，總提取物有抑制LPS激發(fā)的NF-κB核轉(zhuǎn)錄的作用。

綜上所述，炎寧糖漿具有較好的抗炎作用，而其主要抗炎單味中藥為鹿茸草和鴨跖草，在之后實驗會進(jìn)一步比較3種單味藥的藥效作用，分離及篩選三味藥中的活性成分，同時白花蛇舌草是否具有抗炎作用，需要進(jìn)一步體內(nèi)實驗驗證。目前對于炎寧糖漿中主要活性單味藥鹿茸草的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理機制報導(dǎo)還相對較少，進(jìn)一步對其深入研究，可對炎寧糖漿的臨床應(yīng)用和市場推廣產(chǎn)生重要意義及實際價值。