三七總皂苷治療缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制

王 萍，閆東明，黃 茜，鄭曉瓊，任 超，楊兆祥，張建文

(昆藥集團(tuán)股份有限公司藥物研發(fā)平臺生物學(xué)部，云南 昆明 650100)

腦卒中是由于腦部血管突然阻塞或破裂，導(dǎo)致血液不能進(jìn)入大腦相應(yīng)組織，引起的因缺血、缺氧導(dǎo)致的一類腦部疾病。據(jù)最新統(tǒng)計，我國卒中患者總數(shù)以及死亡率已經(jīng)躍居世界第一[1]。阿替普酶(r-tPA)自1996年問世以來，仍然是全球唯一公認(rèn)的臨床上最有效的溶栓治療藥物。然而，由于狹窄的時間窗(4.5 h內(nèi))，以及潛在的出血風(fēng)險和炎性細(xì)胞毒副反應(yīng)，其溶栓率在發(fā)達(dá)國家不到10%，而國內(nèi)的使用率還不到1.5%[1]。因此，開拓針對急性缺血性腦卒中新的治療手段成為了一項(xiàng)巨大和迫切的臨床需求。

缺血性腦損傷病理生理十分復(fù)雜，是一個多信號通路同時激活，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的過程。在此過程中，免疫細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的活化是觸發(fā)缺血后炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。臨床治療中，把溶栓療法與其他神經(jīng)保護(hù)制劑聯(lián)用，以減少r-tPA使用過程中出現(xiàn)的再灌注損傷，并且延長溶栓治療窗已成為當(dāng)今卒中治療新的探索方向，也有可能成為未來卒中治療的主要手段[2]，其中溶栓法與抗炎癥神經(jīng)保護(hù)劑聯(lián)用的研究進(jìn)展最為引人矚目。近期，1項(xiàng)由200名急性缺血性卒中患者參與的前瞻性臨床研究證明，三七總皂苷(PanaxNotoginsengsaponins，PNS)與r-tPA聯(lián)用不但降低了溶栓過程中患者的出血性轉(zhuǎn)化風(fēng)險，而且聯(lián)合治療組患者在12個月后隨訪調(diào)查預(yù)后更好[3]，該研究表明PNS可用于卒中的搶救治療。本研究采用凝血酶致大鼠腦缺血模型，考察了r-tPA、PNS聯(lián)用對模型動物腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，證實(shí)兩藥聯(lián)用可以明顯減少卒中動物的腦損傷和神經(jīng)功能評分。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器紅四氮唑(TTC)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；凝血酶(Lot：T4648)、Percoll(Lot：P4937)、膠原蛋白酶(Type XI，Lot：C7657；TypeI-S，Lot：C1639)、透明質(zhì)酸酶(Lot：H1115000)、Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS，Lot：D8662)、細(xì)胞篩(Lot：Z742103)、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS，Lot：025M4040V)，均為Sigma公司產(chǎn)品；小鼠F4/80熒光抗體，購于BD公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清，購于BI公司；PNS由昆藥集團(tuán)股份有限公司提供；阿替普酶(批號：705546)購自勃林格殷格翰；依達(dá)拉奉注射液(批號：618160521)，南京先聲東元制藥有限公司產(chǎn)品；泊馬度胺(pomalidomide，Lot：S156703)購自Selleck公司；小鼠TNF-α ELISA試劑盒(Lot：228271215)、小鼠IL-6 ELISA試劑盒(Lot：220680144)購于聯(lián)科生物。Biofuge冷凍高速離心機(jī)(Thermo公司)；Adventurer天平(奧豪斯儀器上海有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(BioTek公司)；Accuri C6流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.2動物模型的制備與分組處理

1.2.2凝血酶致大鼠局灶性腦缺血模型 凝血酶致大鼠局灶性腦缺血模型制作過程，參照郝春華等[5]報道方法，簡述如下。健康♂SD大鼠，分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組、缺血后3 h給藥組(分別為r-tPA組、r-tPA+PNS 10 mg·kg-1組、r-tPA+PNS 40 mg·kg-1組)，將大鼠以12%的水合氯醛腹腔注射麻醉(360 mg·kg-1)后，仰臥固定于手術(shù)臺上。室溫維持在25℃左右。切開右側(cè)頸部皮膚，分離、結(jié)扎右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及其分支動脈。分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動脈，至鼓泡處可見其顱外分支翼腭動脈，根部結(jié)扎該分支。在頸外動脈遠(yuǎn)端結(jié)扎備線、放置動脈夾，頸外動脈拉直后在分叉處切口，插入改造過的充滿凝血酶(5 U·μL-1)的PE-50管，管較粗端連接微量注射器，將PE-50管細(xì)端預(yù)先吸入4 μL凝血酶，然后經(jīng)頸外動脈、頸內(nèi)動脈插入至大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)起始端附近，回抽10 μL動脈血并留置10 min，后將血栓及凝血酶一起推入血管，留置導(dǎo)管至15 min后拔出。扎緊備線并縫合皮膚，并將手術(shù)大鼠分籠飼養(yǎng)。各實(shí)驗(yàn)組分別于缺血后3 h靜脈注射給藥，給藥體積為2 mL·kg-1。術(shù)后24 h斷頭取腦，將大腦平均冠狀切為5片，放于TTC溶液中，37℃溫育5～10 min染色，隨后拍照統(tǒng)計。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測線栓法致小鼠局灶性腦缺血梗死側(cè)大腦巨噬細(xì)胞的聚集健康ICR小鼠，♂，體質(zhì)量(27±1)g，由昆藥集團(tuán)提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK (滇)K2014-0001。根據(jù)體質(zhì)量均勻分為3組，分別為假手術(shù)組、模型組、PNS 70 mg·kg-1組(再灌同時靜脈注射給藥)。參照文獻(xiàn)[6]的方法制備缺血/再灌模型，并于24 h后迅速處死小鼠，取出大腦，分離左右半腦，取右腦以DPBS沖洗后，按照文獻(xiàn)[7]的方法得到大腦單細(xì)胞混懸液，計數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109·L-1。隨后加入1 mL含1%胎牛血清的DPBS，以1 000 r·min-1離心5 min，去上清后，剩余約100 μL細(xì)胞混懸液，隨即加入小鼠F4/80熒光抗體，于4℃避光孵育20 min。再加入1 mL含1%胎牛血清的DPBS，1 000 r·min-1離心5 min，洗去殘留抗體，去上清后，剩余約500 μL細(xì)胞混懸液，加2%的多聚甲醛固定。用流式細(xì)胞儀檢測，每個樣品檢測1×105個細(xì)胞。

1.4巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞LPS刺激實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的RAW264.7和BV-細(xì)胞(細(xì)胞株均來源于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108·L-1，每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體分組為RAW264.7細(xì)胞：空白對照組、LPS(0.1 mg·L-1)處理組、LPS(0.1 mg·L-1)+PNS(100 mg·L-1)處理組、LPS(0.1 mg·L-1)+泊馬度胺(0.1 μmol·L-1)處理組；BV-細(xì)胞：空白對照組、LPS(0.5 mg·L-1)處理組、LPS(0.5 mg·L-1)+PNS(100 mg·L-1)處理組、LPS(0.5 mg·L-1)+泊馬度胺(0.1 μmol·L-1)處理組，泊馬度胺為陽性藥。各組處理24 h后，收集培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α和IL-6的水平。

2 結(jié)果

2.1不同時間給予PNS對線栓法致局灶性腦缺血模型大鼠的影響造模后，大鼠出現(xiàn)明顯的行為學(xué)缺陷，同時出現(xiàn)明顯的腦組織壞死，表明造模成功(Tab 1、Fig 1)。再灌注后，立即尾靜脈給予PNS(10 mg·kg-1)對大鼠的行為學(xué)評分及腦梗死百分率都有明顯的降低作用(P<0.01)。為了探討PNS對卒中損傷的預(yù)防性治療效果，再灌注前10 min尾靜脈給予PNS(10 mg·kg-1)，結(jié)果表明，預(yù)防給藥組大鼠的行為學(xué)評分及腦梗死面積有明顯的改善(P<0.05)。陽性對照藥依達(dá)拉奉注射液(5 mg·kg-1)可明顯降低大鼠的行為學(xué)評分及腦梗死百分率(P<0.05，P<0.01)。

2.2聯(lián)合用藥對凝血酶致局灶性腦缺血模型大鼠的治療作用為了探討PNS與r-tPA聯(lián)用減少卒中后再灌注損傷的機(jī)制，建立了與臨床相關(guān)度較高的凝血酶致大鼠局灶性腦缺血模型。造模后，大鼠有明顯的行為學(xué)缺陷，同時出現(xiàn)了明顯的腦組織壞死，表明造模成功(Tab 2、Fig 2)。缺血后3 h尾靜脈給予r-tPA，對大鼠的行為學(xué)評分及腦梗死百分率都有明顯的降低作用(P<0.05)，表明通過r-tPA啟動的溶栓作用使血栓溶解，并實(shí)現(xiàn)了再灌；r-tPA聯(lián)合PNS低劑量組(10 mg·kg-1)可降低大鼠的腦梗死百分率及行為學(xué)評分，但與r-tPA組比較差異無顯著性(P>0.05)。然而，r-tPA聯(lián)合PNS高劑量組(40 mg·kg-1)明顯降低了大鼠的行為學(xué)評分及腦梗死百分率(P<0.01)，且與r-tPA單獨(dú)使用組相比，腦梗死面積有進(jìn)一步減少的趨勢(P=0.073)。

Tab 1 Protective effect of PNS on neurological defects and infarct volume in the ischemia-reperfusion

*P<0.05，**P<0.01vsmodel group

Tab 2 Protective effect of PNS combined with r-tPA on neurological defects and infarct volume in the ischemia-reperfusion

##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

2.3PNS對小鼠局灶性腦缺血梗死側(cè)大腦巨噬細(xì)胞聚集的影響在小鼠腦梗模型中，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型鼠梗死側(cè)大腦巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，而給予70 mg·kg-1PNS后，巨噬細(xì)胞數(shù)量呈下降趨勢(Fig 3)。表明PNS有降低巨噬細(xì)胞向受損腦組織浸潤的抗炎作用。

Fig 3 Assessment of macrophage infiltrationin mice ischemic A:The result of flow cytometry; B:Bar graph of flow cytometry results. ##P<0.01 vs sham group; **P<0.01 vs model group.

2.4PNS對巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性因子的調(diào)節(jié)作用大量研究表明，體內(nèi)巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活，是引發(fā)卒中性腦部炎癥反應(yīng)的第一步，因此，研究巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞體外的激活與抑制，成為探索炎癥反應(yīng)體內(nèi)機(jī)制的基本手段。本研究采用PNS預(yù)處理與LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞(RAW264.7)和小膠質(zhì)細(xì)胞(BV-)分泌炎性因子的方法，探索PNS對兩種細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。Fig 4結(jié)果表明，PNS對巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TNF-α和IL-6能力有明顯的抑制作用。

3 討論

神經(jīng)血管單元(neurovascular unit，NVU)是一個近期提出的描述大腦組織與周邊微環(huán)境的概念[8]。NVU由微血管、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)元軸突及胞外基質(zhì)構(gòu)成。這一理論為解讀卒中過程中的病理過程，以及研究參與這一病理過程中各種組織變化，提供了理論基礎(chǔ)，同時也逐漸成為卒中急救過程中的臨床指導(dǎo)。基于這一理論，中風(fēng)的干預(yù)性治療主要涉及兩個過程，即血管和神經(jīng)兩部分。前者是盡快實(shí)現(xiàn)再灌注，即溶栓或介入取栓治療；而后者則是阻斷缺血/再灌引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)以降低腦損傷，即神經(jīng)保護(hù)治療。在臨床上，為了獲得對卒中患者最大的治療效益，在使用溶栓法實(shí)現(xiàn)再灌基礎(chǔ)上，盡早實(shí)施神經(jīng)保護(hù)將是一種理性的治療方案。

江西在茶葉出口上還是有一定的產(chǎn)品優(yōu)勢的，但光有這些優(yōu)勢還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。通過本文的數(shù)據(jù)分析可以看出江西茶葉雖然在出口數(shù)量和出口額方面都在增加，但在發(fā)展過程中還是存在一些問題的，如生產(chǎn)規(guī)模小、機(jī)器化程度低、產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一等。因此，本文依據(jù)江西省茶葉出口的現(xiàn)狀，同時借鑒其他學(xué)者的研究分析成果，得到出幾點(diǎn)應(yīng)對這些問題的措施，如擴(kuò)大企業(yè)規(guī)模、提高機(jī)械化水平、優(yōu)化產(chǎn)品結(jié)構(gòu)等。希望本文的研究可以在一定程度上助力江西茶葉利用自己的優(yōu)勢將江西的茶文化以及茶葉推向世界，同時提高出口茶葉的質(zhì)量，促進(jìn)江西經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

PNS的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制已有大量的闡述，其中主要集中在抗氧化、抗血管損傷、抗血小板聚集等方面的研究。近期人們把研究的目光聚焦在PNS的免疫調(diào)節(jié)與抗炎機(jī)制方面。有研究提示，PNS可能通過抑制NF-κB激活，降低細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)在中性粒細(xì)胞表達(dá)，以減少中性粒細(xì)胞浸潤反應(yīng)，從而保護(hù)由心肌缺血/再灌注引起的損傷[9-10]。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)，PNS的神經(jīng)保護(hù)作用可能是基于對巨噬細(xì)胞Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)通路的直接抑制。PNS主要由5種皂苷單體構(gòu)成(R1、Rb1、Rg1、Re、Rd)，其中的Rb1在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成稀有型皂苷CK，是人參皂苷二醇組代謝產(chǎn)物的代表。研究發(fā)現(xiàn)，稀有型皂苷CK有明顯的抗缺血性腦損傷作用，這一活性源于其對腦膠質(zhì)細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)功能[12]。越來越多的研究表明，缺血/再灌觸發(fā)的腦部“非感染性”炎癥反應(yīng)是主導(dǎo)卒中中后期腦損傷的主要病理機(jī)制，干預(yù)腦部炎癥反應(yīng)是最佳的卒中后腦保護(hù)措施之一。

本研究的目的在于通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，對李春生等[3]在臨床上觀察到的PNS與r-tPA聯(lián)用的有效性做初步的藥效學(xué)機(jī)制探討。為了更好模擬卒中患者搶救中臨床上實(shí)施的溶栓過程，我們建立了凝血酶誘導(dǎo)缺血性卒中聯(lián)合r-tPA溶栓大鼠模型，并發(fā)現(xiàn)r-tPA與PNS聯(lián)用組的腦保護(hù)作用(梗死面積與神經(jīng)功能評分)優(yōu)于單用r-tPA。大鼠線栓法模型是目前使用最多的卒中動物模型之一，使用該模型我們發(fā)現(xiàn)，無論是預(yù)防性給藥(再灌前10 min)或是治療性給藥(再灌時同時給藥)均可以明顯降低模型動物腦損傷，而且與預(yù)防性給藥組相比，再灌時同時給藥(治療性給藥組)PNS的腦保護(hù)作用更強(qiáng)。有研究資料提示，缺血后缺血核心區(qū)的血流量將降低至正常狀態(tài)的5%～10%，而半陰影區(qū)的血流量也將下降30%～40%，形成低灌注帶[13]，這顯然直接影響到藥物分子進(jìn)入靶器官的濃度。此外，由缺血造成的顱內(nèi)高壓也會影響藥物的傳遞。因此，提示在卒中治療過程中，神經(jīng)保護(hù)劑PNS的最佳給藥時間應(yīng)該是在溶栓或取栓的同時。

為了探索PNS在大鼠卒中模型中觀察到的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，我們使用流式細(xì)胞術(shù)分別對模型組和PNS藥物組小鼠腦組織巨噬細(xì)胞浸潤狀態(tài)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)給予PNS藥物組的模型鼠梗死側(cè)大腦巨噬細(xì)胞的浸潤明顯低于模型組，提示PNS可能通過其固有的機(jī)制，調(diào)低了巨噬細(xì)胞對缺血腦組織部位的浸潤，從而降低了腦部的炎癥反應(yīng)程度。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PNS對卒中炎癥反應(yīng)直接關(guān)聯(lián)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，我們利用巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行LPS刺激培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)PNS能明顯降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IL-6的分泌。這一結(jié)果與之前其他研究者報道的結(jié)論完全相同[14]。

炎癥反應(yīng)是主宰缺血中后期腦損傷的關(guān)鍵因素。PNS是一種擁有多效性的神經(jīng)保護(hù)劑，其中抗炎癥反應(yīng)可能是其在抗缺血/再灌腦損傷中發(fā)揮作用的關(guān)鍵藥理學(xué)機(jī)制。隨著血管內(nèi)介入取栓療法的日趨成熟和普及，如何防止介入取栓過程中誘發(fā)的再灌注損傷，也已經(jīng)成為目前臨床上亟待解決的難題。進(jìn)一步探索PNS與溶栓法聯(lián)用的合適配比與使用時間，也為未來PNS作為配合治療介入取栓手術(shù)打下基礎(chǔ)，使更多卒中患者在接受溶栓或介入取栓治療時，獲得更大的治療效益。

(致謝：本研究中凝血酶誘導(dǎo)大鼠腦血栓模型構(gòu)建得到上海醫(yī)學(xué)工程院劉麗、王志勇博士的指導(dǎo)和支持，特此鳴謝！)