逆轉(zhuǎn)素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖、克隆形成及凋亡的影響

朱玲玲，林濤發(fā)，謝麗平，王少揚(yáng)

(1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院感染科，安徽 蕪湖 241001；2. 廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院感染科，福建 福州 350001；3. 福州總醫(yī)院傳染病教研室，福建 福州 350001)

我國(guó)肝癌發(fā)病率居全球首位，每年超38萬(wàn)人死于肝癌，約占全球肝癌死亡人數(shù)一半[1]。肝癌起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，且惡性程度高、侵襲性強(qiáng)，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此，開(kāi)發(fā)出有效的治療藥物具有重要意義。逆轉(zhuǎn)素(reversine)是一種人工合成的小分子嘌呤類似物，在包括人前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[2-4]。Reversine的抗癌作用可能與其抑制Aurora激酶的活性有關(guān)。D′Alise等[5]發(fā)現(xiàn)，reversine可抑制白血病細(xì)胞的克隆形成，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用較另一種已處于II期臨床試驗(yàn)階段的Aurora激酶抑制劑VX-680更小。此外，Hua等[6]在裸鼠成瘤模型上也證實(shí)reversine可抑制腫瘤的生長(zhǎng)。目前，reversine在肝細(xì)胞癌中的影響作用研究較少，本文就reversine對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、克隆形成及凋亡的影響進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器Reversine購(gòu)于美國(guó)MedChemexpress生物科技公司，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，儲(chǔ)存濃度為10 mmol·L-1，置于-20℃冰箱保存。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；MTS細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，均購(gòu)自于美國(guó)Millipore公司；兔抗活化多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerases, PARP](D64E10)、Bax(E63)、Bcl-2(E17)、Bcl-xl(E18)抗體，購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；細(xì)胞裂解液、鼠抗人β-actin(AC-74)、β-tubulin(b-5-1-2)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，均購(gòu)自碧云天公司。酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；凝膠掃描分析系統(tǒng)(印度Syngene公司)。

1.2細(xì)胞與培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。用0.25%的胰酶消化。

1.3細(xì)胞增殖能力檢測(cè)采用MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)reversine對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入含不同濃度reversine(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol·L-1)的DMEM高糖培養(yǎng)基100 μL，對(duì)照組加入含0.01% DMSO的DMEM高糖培養(yǎng)基100 μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h后，棄原培養(yǎng)基，每孔加入含MTS標(biāo)記試劑的DMEM高糖培養(yǎng)基(培養(yǎng)基 ∶MTS標(biāo)記試劑=5 ∶1)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)并記錄在490 nm及690 nm處的吸光度值。使用公式計(jì)數(shù)出抑制率：抑制率/%=(1-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù))×100%，并計(jì)算出IC50。

1.4細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè)為評(píng)估reversine對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的遠(yuǎn)期效應(yīng)，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)其作用。將HepG2細(xì)胞消化重懸后計(jì)數(shù)，于6孔板中每孔接種1 000個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，將各孔更換為含有不同濃度reversine(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組加入等量DMSO，各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱孵育2周后，棄上清，用結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗3次，統(tǒng)計(jì)克隆形成數(shù)目，并比較各組克隆形成的差異。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度reversine(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol·L-1)孵育48 h，DMSO作為陰性對(duì)照。收集細(xì)胞沉淀，用500 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，在室溫避光條件下孵育15 min，然后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。

1.6Westernblot法分析蛋白表達(dá)HepG2細(xì)胞經(jīng)不同分組處理后，收集細(xì)胞沉淀，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌3遍，吸棄上清，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液充分混勻，置于冰上裂解30 min。隨后于4℃、12 000×g離心10 min，取上清，采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，并制備成蛋白樣品。SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃搖床孵育過(guò)夜，次日用TBST洗滌3遍。加入TBST稀釋的二抗，室溫?fù)u床孵育1 h。TBST洗滌3遍，ECL化學(xué)發(fā)光試劑于凝膠掃描分析儀中檢測(cè)并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1Reversine抑制HepG2細(xì)胞的增殖HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度reversine(0.1～1.6 μmol·L-1)處理后，各組細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨reversine濃度增加，細(xì)胞密度及細(xì)胞狀態(tài)逐漸下降，圓形懸浮細(xì)胞增加，且細(xì)胞核有變大趨勢(shì)(Fig 1A)。MTS檢測(cè)結(jié)果顯示，reversine濃度越高，對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯，并且呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系(Fig 1B)。根據(jù)MTS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，HepG2的IC50值為0.94 μmol·L-1。

2.2Reversine抑制HepG2細(xì)胞的克隆形成能力Fig 2的克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度reversine(0.1～1.6 μmol·L-1)處理后，細(xì)胞的克隆形成能力明顯下降(P<0.05)，且較高濃度reversine處理組(0.2～1.6 μmol·L-1)的HepG2細(xì)胞幾乎不能形成肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆。

Fig 1 Effect of reversine on cell viability of HepG2 cells n=3)

2.3Reversine誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度reversine(0.1～1.6 μmol·L-1)處理后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。如Fig 3所示，與對(duì)照組(DMSO)相比，HepG2細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率均隨reversine濃度增加而增加，呈劑量依賴關(guān)系。

2.4Reversine對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 4結(jié)果顯示，隨reversine濃度的增加，活化的PARP水平明顯增加，說(shuō)明reversine可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。同時(shí)，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL蛋白表達(dá)下降，提示reversine誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)線粒體凋亡途徑。

3 討論

肝癌嚴(yán)重危害人類健康，目前以手術(shù)為主的治療方案療效仍不甚理想。人工合成的小分子嘌呤類似物reversine被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用，研究證實(shí)reversine可抑制前列腺癌、宮頸癌、白血病、人口腔鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、人尿路上皮細(xì)胞腫瘤等腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)回顧所知，目前reversine對(duì)肝癌的研究還未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)導(dǎo)。原發(fā)性肝癌中肝細(xì)胞癌占85%～90%，在本研究中，我們探討了reversine對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的影響作用。我們通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTS)、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，論證了reversine對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用。結(jié)果顯示，reversine可以明顯抑制肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞增殖和克隆形成，并誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡，且與reversine的劑量呈正相關(guān)。

Fig 2 The colony formation ratio of HepG2 after treatment with different concentrations of reversine n=3)

PARP具有蛋白修飾和DNA修復(fù)功能，在細(xì)胞凋亡中起到重要作用[7]。在凋亡過(guò)程中，PARP可被活化的caspase-3裂解為兩個(gè)分子量較小的片段，即可導(dǎo)致?lián)p傷DNA無(wú)法及時(shí)修復(fù)，促使細(xì)胞凋亡，又為細(xì)胞凋亡儲(chǔ)備了更多能量。真核細(xì)胞核內(nèi)PARP含量豐富，在凋亡早期就可檢測(cè)到PARP裂解片段，可作為檢測(cè)凋亡的指標(biāo)之一[8]。本研究Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活化的PARP水平增加，從蛋白水平也證實(shí)了reversine可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡。

Fig 3 Apoptotic rate of HepG2 cells under different concentrations of reversine n=3)A: HepG2 cells were treated with DMSO or reversine, and the appototic cells were assessed by flow cytometry; B: The rates of appotosis in HepG2 cells treated with or without reversine. **P<0.01 vs DMSO group.

Fig 4 Expression of Bcl-2, Bcl-xL, Bax and cleaved-PARP in HepG2 cells after treatment with different concentrations of reversine n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group

線粒體是機(jī)體發(fā)生凋亡的重要場(chǎng)所，Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白Bax和Bak是主要的調(diào)控蛋白，可致線粒體外膜透性化，緊接著向胞質(zhì)內(nèi)釋放細(xì)胞色素C和凋亡蛋白酶激活因子，形成凋亡復(fù)合體，進(jìn)一步活化caspase-9、caspase-3和caspase-7，最終細(xì)胞降解死亡[9]。Bcl-2蛋白家族的另外兩大成分抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL可與促凋亡蛋白Bax和Bak相互作用，參與線粒體凋亡途徑[10]。本研究Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Bax的表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL表達(dá)下降，提示reversine誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)線粒體凋亡途徑?？赏ㄟ^(guò)進(jìn)一步檢測(cè)caspase-9、caspase-3和caspase-7的表達(dá)來(lái)驗(yàn)證。

Aurora激酶是有絲分裂過(guò)程中關(guān)鍵性調(diào)節(jié)酶[11]，在哺乳動(dòng)物中的Aurora激酶包括3個(gè)家族成員，即Aurora A、Aurora B、Aurora C。Aurora A主要參與調(diào)節(jié)中心體成熟和分離，促進(jìn)有絲分裂紡錘體裝配，同時(shí)可通過(guò)調(diào)控cyclin B/CDK1復(fù)合物來(lái)干預(yù)細(xì)胞有絲分裂。Aurora B可調(diào)控紡錘體穩(wěn)定性和染色體凝結(jié)、排列及胞質(zhì)分裂。目前關(guān)于Aurora C的功能尚無(wú)明確的研究證據(jù)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Aurora激酶在包括肝癌等諸多腫瘤中高表達(dá)[12-14]，因此，Aurora激酶成為抗腫瘤的重要靶點(diǎn)之一。Reversine作為一種新型Aurora激酶的抑制劑，在肝癌中是否可通過(guò)抑制Aurora激酶活性來(lái)干預(yù)肝癌細(xì)胞的有絲分裂，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞周期阻滯，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖，有待于進(jìn)一步探討。此外，在活體內(nèi)reversine是否同樣可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，也可通過(guò)裸鼠成瘤模型來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述，reversine可以有效抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖和克隆形成，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其深入的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

(致謝：本研究是在廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，在此致以由衷的感謝！)