淫羊藿次苷Ⅱ?qū)σ鞍俸蠅A所致肺動脈重構(gòu)大鼠凋亡相關(guān)蛋白的影響

李葉麗，廖 婭，錢志強，朱 玲，李意奇，楊丹莉

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)藥理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是以肺動脈重構(gòu)、肺小動脈痙攣為主要特征的一種惡性心血管疾病。其中，肺動脈重構(gòu)是PAH最常見的病理表現(xiàn)，也是PAH形成的重要標(biāo)志[1-2]。肺動脈平滑肌細胞的增殖與凋亡失衡是肺動脈腔變窄、肺血管阻力增加，引發(fā)肺動脈重構(gòu)的重要原因[2-3]。近年研究表明，在野百合堿(monocrotaline, MCT)誘導(dǎo)的PAH模型中，肺動脈平滑肌細胞明顯增殖，且加重了肺動脈重構(gòu)的發(fā)生[3-4]。因此，抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖，促進其凋亡是抑制肺動脈重構(gòu)、治療PAH的關(guān)鍵。淫羊藿次苷Ⅱ(icarisideⅡ, ICSⅡ)是小檗科植物淫羊藿的主要活性成分之一，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用[5-7]。已有研究表明，ICSⅡ?qū)Χ喟l(fā)性骨髓瘤細胞U266、肝母細胞瘤HepG2等多種腫瘤細胞均具有促凋亡作用[8-10]。故本課題組推測，ICSⅡ可能對肺動脈平滑肌細胞也有促凋亡的作用。因此，本研究以MCT誘導(dǎo)的肺動脈重構(gòu)大鼠為研究對象，觀察ICSⅡ?qū)Ψ蝿用}重構(gòu)的作用，并探討其機制是否與促進肺動脈平滑肌細胞的凋亡有關(guān)。

1 材料與方法

1.1實驗動物、藥物及試劑SD大鼠，♂，體質(zhì)量(210±10)g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心，SPF級，許可證號：SCXK(渝)2012-0005。ICSⅡ(純度≥98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，結(jié)構(gòu)式見Fig 1)；MCT(純度≥98%，美國Sigma公司)；TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒(德國Roche公司)；Bax、Bcl-2、活化的caspase-3抗體(美國Abcam公司)；HRP 標(biāo)記的β-actin抗體(上?？党缮锛夹g(shù)有限公司)；ECL發(fā)光劑(七海生物有限公司)。

1.2儀器Mini-PROTEAN3電泳儀、Mini Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、CCD成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3MCT的配制稱取0.5 g MCT溶于10 mL 0.5 mo1·L-1的鹽酸中，用0.5 mo1·L-1氫氧化鈉調(diào)pH至7.4，加生理鹽水定容至50 mL。

1.4實驗分組、造模及給藥40只大鼠隨機分為對照組(Control)、模型組(Model)、ICSⅡ低劑量組(ICSⅡ-L，4 mg·kg-1)、ICSⅡ中劑量組(ICSⅡ-M，8 mg·kg-1)、ICSⅡ高劑量組(ICSⅡ-H，16 mg·kg-1)，每組8只。對照組經(jīng)頸背部一次性皮下注射生理鹽水5 mL·kg-1，其余4組注射MCT 50 mg·kg-1誘導(dǎo)肺動脈重構(gòu)模型。ICSⅡ各劑量組于造模后d 1開始每天灌胃給藥，至d 28結(jié)束?？瞻捉M和模型組灌胃給予等量溶媒。

Fig 1 The structural formula of ICS Ⅱ

1.5肺小動脈形態(tài)學(xué)觀察取各組大鼠左肺遠離肺門處5 mm左右的肺組織，于4%甲醛溶液中固定48 h后，脫水、包埋、切片，進行HE染色，光鏡下觀察肺小動脈形態(tài)學(xué)變化，并拍照記錄。

1.6肺動脈平滑肌細胞凋亡的檢測TUNEL法測定肺動脈平滑肌細胞凋亡，光鏡下觀察每組肺動脈平滑肌細胞凋亡情況，計算400倍視野下凋亡細胞數(shù)目占總細胞數(shù)的百分比。其中正常細胞核顯藍色，凋亡陽性細胞核呈棕黃色或褐色。

1.7肺組織Bax、Bcl-2、活化的caspase-3蛋白的檢測取各組肺組織約100 mg，提取總蛋白后采用BCA法定量。12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉2 h后，加入一抗Bax(1 ∶1 000稀釋)、Bcl-2(1 ∶1 000稀釋)、活化的caspase-3(1 ∶5 000稀釋)、β-actin(1 ∶5 000稀釋)4℃孵育16 h，室溫孵育二抗1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Quantity One定量分析軟件進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1ICSⅡ?qū)CT所致大鼠肺小動脈形態(tài)學(xué)的影響對肺小動脈形態(tài)初步觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠肺小動脈中膜及管壁增厚、管腔狹窄、血管周圍及肺間質(zhì)炎癥細胞浸潤明顯。與模型組相比，ICSⅡ給藥組大鼠肺小動脈中膜及管壁變薄、管腔增大、血管周圍及肺間質(zhì)炎癥減輕(Fig 2)。

2.2ICSⅡ?qū)CT所致大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡的影響如Fig 3所示，與對照組相比，模型組肺動脈平滑肌細胞發(fā)生凋亡，TUNEL陽性細胞比率升高(P<0.05)。與模型組相比，ICSⅡ中、高劑量組肺動脈平滑肌細胞凋亡數(shù)均明顯增加，TUNEL陽性細胞比率升高(P<0.05)。

2.3ICSⅡ?qū)CT所致大鼠肺組織Bax、Bcl-2蛋白表達的影響如Fig 4所示，與對照組相比，模型組大鼠肺組織Bax、Bcl-2蛋白表達上調(diào)(P<0.05)，Bax/Bcl-2的比值升高(P<0.05)。與模型組相比，ICSⅡ中、高劑量組大鼠肺組織Bax蛋白的表達明顯上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達明顯下調(diào)(P<0.05)，Bax/Bcl-2的比值升高(P<0.05)。

2.4ICSⅡ?qū)CT所致大鼠肺組織活化的caspase-3水平的影響如Fig 5所示，與對照組相比，模型組大鼠肺組織活化的caspase-3的水平升高 (P<0.05)。與模型組相比，ICSⅡ中、高劑量組大鼠肺組織活化的caspase-3的水平明顯升高(P<0.05)。

3 討論

隨著對PAH研究的不斷深入，肺動脈重構(gòu)在PAH中的作用日益受到重視。肺動脈重構(gòu)是不同原因所致PAH的共同病理生理基礎(chǔ)，亦是近年P(guān)AH發(fā)病機制的主要研究方向。本研究采用MCT誘導(dǎo)的肺動脈重構(gòu)模型，觀察ICSⅡ?qū)Ψ蝿用}重構(gòu)的作用，并探討其機制是否與促進肺動脈平滑肌細胞的凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與對照組比，模型組肺小動脈中膜明顯增厚、管腔變窄、炎癥細胞浸潤明顯，提示模型成功，與文獻報道一致[11]。與模型組比，ICSⅡ給藥組大鼠肺小動脈中膜變薄、管腔增大、炎癥減輕，提示ICSⅡ具有抗MCT所致大鼠肺動脈重構(gòu)的作用。

Fig 2 Effect of ICS Ⅱ on pulmonary histomorphology induced by MCT in rats(×200)

Fig 3 Effect of ICS Ⅱ on pulmonary arterysmooth muscle cell apoptosis inducedby MCT in rats(×400)

Fig 5 Effect of ICS Ⅱ on the expression of apoptosis-relatedprotein activated caspase-3 in MCT-induced

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsmodel

為進一步探討ICSⅡ抗肺動脈重構(gòu)的作用機制，本研究采用TUNEL染色觀察了ICSⅡ?qū)CT所致大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比，給予ICSⅡ后大鼠的肺動脈平滑肌細胞凋亡明顯增加，TUNEL陽性細胞比率升高。提示ICSⅡ抗肺動脈重構(gòu)的作用與促進肺動脈平滑肌細胞的凋亡有關(guān)。細胞凋亡是外界刺激和細胞自身因素共同作用的結(jié)果。Bcl-2家族是調(diào)控細胞凋亡的重要因子，按其功能可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩種。Bax是Bcl-2家族中主要的促凋亡蛋白，Bcl-2是主要的抗凋亡蛋白，Bax/Bcl-2的比值是影響細胞凋亡的關(guān)鍵因素。細胞發(fā)生凋亡的同時會引起線粒體釋放細胞色素C，激活caspase-3，使caspase-3活化，從而促進細胞凋亡[12]。

淫羊藿又名仙靈脾，為小檗科淫羊?qū)?EpimediumL.)植物，是中國傳統(tǒng)的益補中藥之一，具有“補肝陽、強筋骨、陽益精和祛風(fēng)濕”的功效。ICSⅡ是淫羊藿的主要活性成分之一。已有研究表明，ICSⅡ可通過促進caspase-3的活化，促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞的凋亡[13]。在本研究中，與模型組比，給予ICSⅡ后肺組織Bax/Bcl-2比值增加，caspase-3的活化水平明顯上調(diào)。提示ICSⅡ促進肺動脈平滑肌細胞凋亡的機制可能與下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax和活化的caspase-3的表達有關(guān)。

有趣的是，與對照組比，模型組肺組織中Bax/Bcl-2比值上調(diào)，caspase-3的活化水平也增加。Shi等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在MCT誘導(dǎo)的PAH模型中，模型組肺組織中Bax/Bcl-2的比值和caspase-3的活化水平均較對照組明顯上調(diào)，與本研究結(jié)果一致。分析其原因可能是由于肺動脈平滑肌細胞的凋亡速率遠低于其增殖速率，也可能與肺動脈內(nèi)皮細胞的凋亡有關(guān)。內(nèi)皮細胞損傷是引發(fā)肺動脈重構(gòu)的起始因素，也是導(dǎo)致肺動脈平滑肌細胞異常增殖及凋亡受阻的重要原因[14]，故在本研究中即使肺動脈平滑肌細胞發(fā)生了凋亡，但肺動脈重構(gòu)依然明顯。

(致謝：本文所有實驗均在遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室完成，感謝實驗室所有老師的支持與幫助。)