MiR-186-5p通過靶向調(diào)控RAB2A在乳腺癌細胞阿霉素耐藥性中的逆轉(zhuǎn)作用機制

孫玉國，王照巖，楊玉玲，楊志一，尹崇高，李洪利

(濰坊醫(yī)學(xué)院1. 附屬醫(yī)院藥學(xué)部、2. 病理學(xué)教研室、3. 護理學(xué)院、4. 醫(yī)學(xué)研究實驗中心，山東 濰坊 261053)

盡管近年來臨床預(yù)防篩查和治療乳腺癌的技術(shù)已獲得長足發(fā)展，乳腺癌患者預(yù)后也有明顯改善，然而，耐藥性仍是乳腺癌治療過程中不可避免的問題[1]，如阿霉素耐藥、順鉑耐藥等。阿霉素是臨床常見的化療藥之一，且越來越多的研究表明，阿霉素耐藥與微小RNA(microRNAs，miRNAs)的異常表達密切相關(guān)[2]。miRNAs作為一類調(diào)控序列，可結(jié)合mRNA序列的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，以此調(diào)控癌細胞的耐藥增殖，如過表達miR-210抑制胰腺癌的增殖，且可通過靶基因ABCC5逆轉(zhuǎn)吉西他濱的耐藥[3]。miR-101通過抑制膠質(zhì)母細胞瘤糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)表達，逆轉(zhuǎn)替莫唑胺的耐藥[4]。但是關(guān)于miR-186-5p在乳腺癌細胞阿霉素耐藥性中的作用機制研究尚未見報道。本文對阿霉素耐藥株MCF-7/ADR及MCF-7細胞進行共轉(zhuǎn)染，檢測miR-186-5p、RAB2A對耐藥增殖的影響，進一步經(jīng)LY294002處理后，檢測p-Akt308、p-Akt473及Akt的變化，以此闡述miR-186-5p、RAB2A在乳腺癌細胞阿霉素耐藥性中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人乳腺癌細胞株MCF-7購自ATCC。

1.1.2藥物與試劑 阿霉素由濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供(海正輝瑞制藥有限公司，批準文號：國藥準字H33021980)；Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR?Kit、SYBR?Green I染料，均購自TaKaRa公司；RIPA裂解液、CCK-8，購自索萊寶公司；PI3K抑制劑LY294002，購自北京碧云天公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人RAB2A多克隆抗體、兔抗人p-Akt473多克隆抗體、兔抗人p-Akt308多克隆抗體，均購自Abcam公司；胎牛血清和MEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone。

1.1.3儀器 ABI7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，酶標儀(Bio-Tek公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 按照文獻[5,6]，MCF-7、MCF-7/ADR細胞均在含10% FBS的MEM培養(yǎng)基、5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，其中MCF-7/ADR細胞另外添加1.0 mg·L-1的阿霉素以維持其耐藥性，實驗前48 h不再添加阿霉素。細胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000，具體步驟參照操作說明書。參照文獻[9]，細胞轉(zhuǎn)染及共轉(zhuǎn)染分組：① MCF-7組：常規(guī)培養(yǎng)，不做處理；② anti-NC/MCF-7組：轉(zhuǎn)入敲除miR-186-5p的對照質(zhì)粒；③ anti-miR-186-5P/MCF-7組：轉(zhuǎn)入敲除miR-186-5p質(zhì)粒；④ MCF-7/ADR組：MCF-7/ADR細胞常規(guī)培養(yǎng)，不做處理；⑤ NC組：將過表達miR-186-5p的對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MCF-7/ADR細胞；⑥ miR-186-5p組：將過表達miR-186-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MCF-7/ADR細胞；⑦ miR-186-5p+Con組：MCF-7/ADR中同時轉(zhuǎn)入過表達miR-186-5p質(zhì)粒和過表達RAB2A質(zhì)粒的對照質(zhì)粒Con；⑧ miR-186-5p+RAB2A組：MCF-7/ADR中同時轉(zhuǎn)入過表達miR-186-5p質(zhì)粒和過表達RAB2A質(zhì)粒；⑨ Scr+anti-miR-186-5p組：MCF-7中轉(zhuǎn)入敲除RAB2A的對照質(zhì)粒和敲除miR-186-5p的質(zhì)粒；⑩ SiRAB2A+anti-miR-186-5p組：MCF-7中轉(zhuǎn)入敲除RAB2A質(zhì)粒和敲除miR-186-5p質(zhì)粒。

1.2.2雙熒光素酶實驗 將RAB2A的3′-UTR的野生型(pGL3-RAB2A-3′UTR)和突變型(pGL3-RAB2A- 3′UTR-mut)分別與對照質(zhì)粒NC、過表達miR-186-5p質(zhì)粒、對照質(zhì)粒anti-NC、anti-miR-186-5p質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染處理。具體實驗步驟參照文獻[7]。

1.2.3qRT-PCR 用TRIzol法提取各組乳腺癌細胞的總RNA。用莖環(huán)法和普通逆轉(zhuǎn)錄法分別對miR-186-5p和RAB2A進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得第一鏈cDNA后，分別用Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR?Kit和SYBR?Green I染料進行qRT-PCR，miR-186-5p以U6為內(nèi)參，RAB2A以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)條件及miR-186-5p的莖環(huán)序列、引物序列均參照文獻[8]。RAB2A上游引物：5′-ACATCATAATCGGCGACACAGGTG-3′，下游引物：5′ -CATTCGAGCACCGAACTCTACACC-3′。

1.2.4Western blot MCF-7、MCF-7/ADR細胞及轉(zhuǎn)染后的細胞，用RIPA裂解液裂解后進行蛋白抽提，接著進行分離膠濃度為12%的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜，d 2 TBST洗膜，孵育二抗，再次洗膜后，加ECL曝光。一抗稀釋度：RAB2A(1 ∶1 000)、p-Akt308(1 ∶500)、p-Akt473(1 ∶500)、Akt(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000)。

1.2.5CCK-8細胞增殖實驗 取各組細胞2×103個，接種于96孔板中。貼壁培養(yǎng)24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm的吸光度值。以此分別測定MCF、MCF-7/ADR細胞在轉(zhuǎn)染以及共轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h細胞增殖能力的變化。

2 結(jié)果

2.1RAB2A與miR-186-5p靶向結(jié)合通過Targetscan和miRNAMap預(yù)測軟件，得出RAB2A與miR-186-5p存在靶向結(jié)合位點，我們采用雙熒光素酶實驗，檢測RAB2A與miR-186-5p在乳腺癌阿霉素耐藥株MCF-7/ADR中是否存在結(jié)合及調(diào)控相互關(guān)系。Fig 1結(jié)果顯示，miR-186-5p可特異性地結(jié)合于RAB2A的3′UTR。

Fig 1 RAB2A, a direct target of

2.2miR-186-5p、RAB2A在各組乳腺癌細胞中表達采用qRT-PCR分別檢測miR-186-5p、RAB2A在乳腺癌細胞株MCF-7、MCF-7/ADR中mRNA的表達情況，同時，通過Western blot檢測RAB2A的蛋白表達水平。Fig 2結(jié)果顯示，與MCF-7細胞相比，MCF-7/ADR中miR-186-5p的表達水平明顯降低(P<0.05)，RAB2A的mRNA表達沒有明顯變化(P>0.05)，而RAB2A的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。

2.3過表達miR-186-5p抑制乳腺癌細胞的增殖為檢測miR-186-5p對乳腺癌細胞耐藥和增殖的影響，我們通過轉(zhuǎn)染使MCF-7/ADR中的miR-186-5p高表達，敲低MCF-7中的miR-186-5p，CCK-8法檢測細胞增殖能力的變化。Fig 3結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染72 h后，與MCF-7/ADR及NC組細胞相比，miR-186-5p組細胞的增殖能力明顯降低(P<0.05)；與MCF-7及anti-NC組細胞相比，anti-miR-186-5p組細胞的增殖能力明顯增加(P<0.05)。

Fig 2 Expression levels of miR-186-5p and

2.4miR-186-5p負向調(diào)控乳腺癌細胞中RAB2A的表達Western blot檢測miR-186-5p對乳腺癌細胞中RAB2A的影響。如Fig 4所示，過表達MCF-7/ADR中的miR-186-5p及敲低MCF-7中的miR-186-5p后，與NC組細胞相比，miR-186-5p組細胞中RAB2A的表達明顯降低；與anti-NC組細胞相比，anti-miR-186-5p組細胞中RAB2A的表達明顯增加(P<0.05)。

2.5過表達RAB2A逆轉(zhuǎn)miR-186-5p抑制乳腺癌細胞增殖的能力為進一步檢測miR-186-5p是否通過作用于RAB2A，影響乳腺癌細胞的增殖，采用CCK-8檢測共轉(zhuǎn)染后RAB2A、miR-186-5p對乳腺癌細胞增殖能力的影響。如Fig 5所示，共轉(zhuǎn)染72 h后，與miR-186-5p+Con組細胞相比，miR-186-5p+RAB2A組細胞的增殖能力明顯增加(P<0.05)；與miR-186-5p+Scr組細胞相比，miR-186-5p+SiRAB2A組細胞的增殖能力明顯降低(P<0.05)。

Fig 3 Influence of miR-186-5p on cell proliferation in

2.6miR-186-5p負向調(diào)控RAB2A經(jīng)PI3K/Akt信號通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞的阿霉素耐藥和增殖為檢測miR-186-5p是否通過負向調(diào)控RAB2A，經(jīng)PI3K/Akt信號通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞的阿霉素耐藥和增殖，終濃度為20 μmol·L-1的 PI3K抑制劑LY294002添加到共轉(zhuǎn)染后的各組細胞，Western blot檢測p-Akt308、p-Akt473的表達水平。如Fig 6所示，在LY294002處理下，與miR-186-5p+Con組細胞相比，miR-186-5p+RAB2A組細胞的p-Akt308、p-Akt473的表達水平明顯增加(P<0.05)，Akt的表達水平?jīng)]有明顯變化；與miR-186-5p+Scr組細胞相比，miR-186-5p+SiRAB2A組細胞的p-Akt308、p-Akt473表達水平明顯降低(P<0.05)，Akt的表達沒有明顯變化。

Western blot was employed to assess the expression of RAB2A in breast cancer cells after over-expression of miR-186-5p in MCF-7/ADR cells and suppression of miR-186-5p in MCF-7cells.*P<0.05 vs NC or anti-NC

Fig 5 Over-expressed RAB2A restored reduction of

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，且化療是治療乳腺癌的常規(guī)手段。然而，多藥耐藥是導(dǎo)致化療失敗的主要障礙[9]。因此，研究乳腺癌的多藥耐藥機制將為臨床治療乳腺癌提供新的治療靶點和途徑，以期提高患者的預(yù)后。

RAB2A是小GTPase家族中的一員，參與囊泡轉(zhuǎn)運、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的回收及運動。研究發(fā)現(xiàn)，RAB2A與Rab27a通過雙效應(yīng)物Noc2，協(xié)同調(diào)控成熟顆粒向胞外的運輸。Dey等[10]發(fā)現(xiàn)，S100A7可激活RAB2A介導(dǎo)的MAPK信號通路，影響口腔鱗狀細胞癌細胞的運動、侵襲。此外，Luo等[11]發(fā)現(xiàn)，RAB2A激活ERK信號通路，促進乳腺癌干細胞和腫瘤的發(fā)生。本實驗通過雙熒光素酶和Western blot實驗，首次證實miR-186-5p在阿霉素耐藥株MCF-7/ADR中存在RAB2A的結(jié)合位點，且RAB2A表達水平受miR-186-5p調(diào)控。

Fig 6 Over-expressed RAB2A restored effects of p-Akt308,p-Akt 473 by

近年來，大量研究表明miRNAs的失調(diào)與多藥耐藥存在密切關(guān)系。先前文獻表明，miR-186可靶向結(jié)合ABCB1和調(diào)節(jié)GST-π的表達，誘導(dǎo)卵巢癌細胞對紫杉醇、順鉑的耐藥性[12]。同時，miR-186經(jīng)對Twist1的調(diào)控，逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞的順鉑耐藥[13]。Ye等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-186調(diào)控微管相關(guān)蛋白tau(microtubule-associated proteins tau,MAPT)的表達，進而調(diào)節(jié)非小細胞肺癌的化學(xué)耐藥性。近來發(fā)現(xiàn)，TUG1經(jīng)miR-186/CPEB2介導(dǎo)結(jié)直腸癌的甲氨蝶呤耐藥[15]。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p靶向調(diào)控PTTG1，抑制非小細胞肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移[8]。但是，關(guān)于miR-186-5p在乳腺癌阿霉素耐藥和增殖中的作用尚未見報道。本實驗發(fā)現(xiàn)，阿霉素耐藥株MCF-7/ADR中miR-186-5p低表達，過表達miR-186-5p后明顯抑制增殖。過表達RAB2A后明顯逆轉(zhuǎn)了miR-186-5p對增殖的影響，同時，經(jīng)LY294002處理后，Western blot結(jié)果顯示，RAB2A明顯逆轉(zhuǎn)了miR-186-5p對p-Akt308、p-Akt473的影響。此外，我們在MCF-7細胞中獲得相同的結(jié)論。

綜上所述，miR-186-5p負向調(diào)控RAB2A，經(jīng)PI3K/Akt信號通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞的阿霉素耐藥和增殖，過表達RAB2A逆轉(zhuǎn)了miR-186-5p對耐藥和增殖的影響。為臨床治療阿霉素耐藥的乳腺癌患者提供新的治療靶點和理論支撐，以便提出更有效的治療策略。