丹皮酚對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體自噬和死亡的保護作用

王訓翠，朱國旗，賴桂華，李慶林

(1.安徽中醫(yī)藥大學新安醫(yī)學教育部重點實驗室，科研實驗中心，安徽 合肥 230038；2. 安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，安徽 合肥 230032)

帕金森病(Parkinson′s disease, PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其病理特征表現(xiàn)為多巴胺能神經(jīng)元進行性缺失和多巴胺含量的減少。線粒體功能障礙和線粒體自噬異常可能是導致PD發(fā)病的關鍵分子機制之一[1]。最近的研究表明，線粒體自噬促進了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展[2]。在許多PD患者中，發(fā)現(xiàn)DJ-1基因發(fā)生突變，DJ-1缺失會導致氧化應激增加，parkin募集和線粒體自噬增多[3]。研究還發(fā)現(xiàn)在PD患者中，錯誤折疊和聚集的α-突觸核蛋白(α-synuclein)對神經(jīng)細胞具有毒性作用，這種毒性與線粒體自噬增強有關[4]。這些研究報道表明調(diào)控線粒體自噬水平，特別是抑制線粒體自噬的過度發(fā)生，穩(wěn)定線粒體結構和正常功能顯得尤為重要。丹皮酚(paeonol, Pae)是從毛茛科植物牡丹根皮和蘿摩科植物徐長卿干燥根或全草中提取出來的主要活性成分。作者此前的研究已證實，丹皮酚在一定濃度范圍內(nèi)通過阻止谷氨酸或1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenyl pyridine, MPP+)誘導的神經(jīng)細胞線粒體功能損傷，抑制線粒體氧化應激的發(fā)生，維持細胞內(nèi)線粒體功能穩(wěn)定，發(fā)揮對PD細胞模型的神經(jīng)保護作用[5-6]。但丹皮酚是否能抑制神經(jīng)毒性藥物誘導的線粒體自噬，發(fā)揮神經(jīng)保護功能尚不清楚。本課題采用MPP+作用于SH-SY5Y細胞，建立PD體外模型，探討丹皮酚通過調(diào)控線粒體自噬水平發(fā)揮神經(jīng)保護作用的可能機制，為防治PD提供更多的實驗基礎。

1 材料

1.1藥物與試劑丹皮酚(批號20130412，純度>99%)由安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心提供；雷帕霉素(rapamycin，Rap)、丹酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)，均購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，美國Hyclone)；線粒體特異性熒光探針(Mito-Tracker Green)、ECL試劑盒、溶酶體特異性熒光探針(Lyso-Tracker Red)(上海碧云天)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(南京建成)；兔抗parkin、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)、Beclin-1多克隆抗體(Cell Signaling Technology)；鼠抗GAPDH單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)；其余試劑均為分析純。

1.2細胞株人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞，購自美國細胞菌種庫(ATCC)。

1.3儀器MCO-175型CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)；JEM-1230型透射電子顯微鏡(日本電子)；SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇州安泰)；DBI6000倒置熒光顯微鏡、FC500型流式細胞儀(美國Beckman)；電泳及轉印系統(tǒng)(美國Bio-Rad)；TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡(德國Leica)；Alpha FluorChem FC3 化學發(fā)光系統(tǒng)(美國Alpha)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)和處理SH-SY5Y細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，每2～3 d換液1次。取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞，調(diào)整細胞濃度后，根據(jù)實驗需要分別接種于96孔板或6孔板，待細胞貼壁過夜后，按實驗要求加入不同藥物進行處理。將細胞分為正常對照組、MPP+(1 mmol·L-1)處理組和丹皮酚(10 μmol·L-1)處理組。實驗另設雷帕霉素(1 μmol·L-1)處理組。正常對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基；MPP+組和雷帕霉素組加入終濃度分別為1 mmol·L-1MPP+和1 μmol·L-1雷帕霉素的等體積培養(yǎng)基；丹皮酚組預先1 h加入10 μmol·L-1丹皮酚，再加入1 mmol·L-1MPP+處理細胞24 h。

2.2MTT法檢測細胞存活率取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，消化收集后，以5×107·L-1的細胞密度接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁良好后分組加藥。給藥組加不同濃度的丹皮酚溶液，終濃度依次為1、10、100 μmol·L-1，預保護1 h后，再加入1 mmol·L-1MPP+處理細胞24 h，實驗另設正常對照組，每組8個復孔。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入5.0 g·L-1MTT 20 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄全部上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩20 min。用酶標儀(波長490 nm)記錄每孔的吸光度(A)。細胞存活率/%=(實驗組A值/正常對照組A值)×100%，實驗重復3次。

2.3LDH法檢測細胞損傷度SH-SY5Y細胞經(jīng)不同藥物分組處理24 h后，每組吸取6個復孔各50 μL培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒說明書操作，用酶標儀記錄波長340 nm處的吸光度(A)，測定各組LDH的釋放度。

2.4MDC染色流式細胞儀檢測自噬水平SH-SY5Y細胞經(jīng)藥物處理后，棄上清液，PBS洗3次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定10 min，棄上清液，每孔加入終濃度為50 μmol·L-1MDC染液，于37℃培養(yǎng)箱中再溫育30 min，用紫外激發(fā)，在倒置熒光顯微鏡下觀察攝片。另外再用PBS重懸細胞，于流式細胞儀上檢測，平均熒光強度表示細胞內(nèi)酸性自噬泡的數(shù)量。WinMDI2.9軟件分析結果。

2.5透射電子顯微鏡檢測線粒體自噬現(xiàn)象SH-SY5Y細胞經(jīng)分組處理48 h后，1 000 r·min-1離心5 min，收集細胞，棄上清；用預熱37℃的PBS洗滌細胞；傾斜離心管，沿管壁緩緩加入2 mL預冷的1%戊二醛，4℃固定2 h后，1%鋨酸固定1 h；丙酮梯度脫水；浸透，包埋，聚合，超薄切片；醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2.6激光掃描共聚焦顯微鏡檢測亞細胞共定位采用熒光共振能量轉移技術檢測線粒體自噬活性, 用熒光探針Mito-Tracker Green標記線粒體,熒光探針Lyso-Tracker Red標記溶酶體, 經(jīng)激光共聚焦顯微鏡分析溶酶體對線粒體的吞噬活性。SH-SY5Y細胞以1×108·L-1接種于6孔板,待細胞70%～80%融合時，進行藥物處理24 h,每孔加入37℃預熱的75 nmol·L-1Lyso-Tracker Red,15 min后再加入100 nmol·L-1Mito-Tracker Green, 45 min后，用PBS漂洗3次，置激光掃描共聚焦顯微鏡下分析檢測。

2.7Westernblot檢測自噬相關蛋白的表達細胞經(jīng)分組處理24 h后，細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量。每組樣品總蛋白25 μg經(jīng)12% SDS-PAGE電泳，分離蛋白。將分離膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉常溫封閉3 h后，一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜。PBST漂洗3次，每次10 min，二抗常溫孵育2 h，再PBST漂洗3次，每次10 min，然后加入ECL發(fā)光底物，暗室下X線片曝光。蛋白條帶用化學發(fā)光系統(tǒng)分析，采用平均灰度值比較各組蛋白的表達。

3 結果

3.1丹皮酚對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞存活率和損傷度的影響Fig 1的MTT檢測結果顯示，神經(jīng)毒性藥物MPP+誘發(fā)了SH-SY5Y細胞的死亡，與空白對照組比較，MPP+處理組細胞的存活率明顯降低，而預先加入不同濃度丹皮酚處理后，細胞存活率明顯增加(P<0.05)，細胞存活率與丹皮酚的給藥濃度呈一定的量效關系。

神經(jīng)細胞在損傷的過程中，LDH會釋放到培養(yǎng)上清液中，上清液LDH漏出率反映出細胞損傷或死亡程度。Fig 2的LDH檢測結果表明，MPP+處理組細胞培養(yǎng)液中LDH漏出率明顯高于正常對照組(P<0.01)；而丹皮酚與MPP+共同孵育24 h后，細胞上清液中的LDH漏出率明顯下降，并隨著濃度的增加，作用逐漸增強，細胞受損程度明顯減輕。結果表明MPP+誘導了SH-SY5Y細胞的死亡，丹皮酚的保護作用呈濃度依賴性。

Fig 1 Effect of paeonol on MPP+-inducedcell viability in SH-SY5Y

Fig 2 Effect of paeonol on MPP+-inducedLDH leakage in SH-SY5Y

3.2丹皮酚對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞自噬活性的調(diào)控細胞經(jīng)不同濃度的MPP+處理24 h后，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞突起結構明顯減少，多呈梭形，貼壁較差，培養(yǎng)液中可見部分漂浮細胞。細胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，隨著MPP+作用濃度的不斷增加，細胞內(nèi)空泡數(shù)目逐漸增多。而正常對照組細胞數(shù)目明顯增多，細胞貼壁良好，具有多只長短不等的突起，并出現(xiàn)簇狀生長(Fig 3)。

Fig 3 Induction of autophagic vacuoles inSH-SY5Y cells treated with MPP+(×200)

細胞經(jīng)MDC染色后，置熒光顯微鏡下觀察，與正常對照組相比，1 mmol·L-1MPP+作用SH-SY5Y細胞24 h后，細胞內(nèi)熒光信號明顯增強，并出現(xiàn)亮綠色熒光點狀聚集，提示MPP+處理組細胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬空泡聚集，自噬被激活；雷帕霉素處理組細胞狀態(tài)接近于MPP+處理組；而正常對照組細胞發(fā)出均勻的淡綠色熒光，丹皮酚處理組細胞熒光染色信號出現(xiàn)明顯降低，僅見很少量的MDC陽性細胞(Fig 4)。

3.3丹皮酚干預對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞自噬比率的影響細胞經(jīng)不同藥物處理后，通過MDC染色，經(jīng)流式軟件檢測MDC陽性細胞的比率。如Fig 5所示，與正常對照組相比，MPP+處理組和雷帕霉素組平均熒光強度增加，出現(xiàn)峰右移，平均熒光強度(median fluorescence intensity，MFI)值分別為(88.8±3.3)%和(84.9±2.6)%，表明細胞內(nèi)自噬泡(autophagic vacuole，AVO)明顯增多(P<0.01)，提示細胞自噬的發(fā)生。丹皮酚處理組相較于MPP+處理組，其MFI值降為(64.9±3.2)%，顯示熒光信號減弱，表明細胞內(nèi)自噬比率明顯降低。

Fig 4 Effect of paeonol on MPP+-induced AVOs formation in SH-SY5Y cells(×200)

Fig 5 Effect of paeonol on MPP+-induced autophagy formation in SH-SY5Y

Fig6EffectofpaeonolonMPP+-inducedmitophagyinSH-SY5Ycells(×15 000)

A:Control;B:MPP+;C:Pae.Arrows indicate mitophagy.

3.4丹皮酚干預對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體自噬現(xiàn)象的影響電鏡是觀察自噬的“金標準”，自噬發(fā)生的超微結構特征為，雙層膜或多層膜包繞的大小不一的泡狀小體，也稱為自噬泡。如Fig 6所示，MPP+處理組細胞核內(nèi)染色質(zhì)凝聚，細胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬空泡聚集，部分空泡內(nèi)可見內(nèi)容物，線粒體結構紊亂且多空泡化，并有部分線粒體被包裹進囊泡里，且線粒體數(shù)目明顯減少；正常對照組細胞表現(xiàn)結構清晰，核染色質(zhì)分布均勻，各細胞器形態(tài)正常；丹皮酚處理組胞質(zhì)內(nèi)未見明顯空泡，細胞形態(tài)結構均接近于正常對照組。

3.5丹皮酚干預對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體自噬活性的影響細胞經(jīng)處理后，觀察MPP+誘導的自噬體結構、分布的改變及亞細胞共定位情況。激光共聚焦顯微鏡下可見綠色為線粒體探針標記在特定激光下顯影，紅色為溶酶體探針標記在特定激光下顯影。經(jīng)激光共聚焦顯微鏡軟件分析后,兩者立體空間不重合時仍為紅色或綠色；當紅綠熒光立體空間重合時表現(xiàn)為黃色，即溶酶體吞噬線粒體后尚未降解前，紅色和綠色共定位呈現(xiàn)為黃色標記。MPP+處理組可見較多的黃色標記，而正常對照組未見明顯的黃色標記,丹皮酚處理組僅有少量黃色標記(Fig 7)。

3.6丹皮酚干預對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體自噬水平的調(diào)控如Fig 8所示，與正常對照組相比，MPP+處理組自噬相關蛋白Beclin-1的表達明顯上調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增加，parkin蛋白表達水平下降，預先經(jīng)丹皮酚處理后能明顯抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體自噬水平。提示丹皮酚可能減輕MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體自噬的發(fā)生。

Fig 7 Colocalization of with Green-Mito with Red-Lyso(×200)

Fig 8 Effect of paeonol on MPP+-induced mitophagy related-proteins in SH-SY5*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.01,##P<0.01 vs MPP+

4 討論

有研究表明，線粒體的功能和特征使得選擇性易受損的神經(jīng)元從本質(zhì)上對老化和應激的敏感性增高[7]。線粒體功能障礙在神經(jīng)變性疾病發(fā)病機制中起著重要作用，線粒體已經(jīng)成為神經(jīng)變性疾病的軸合點。事實上，線粒體自噬可能是把“雙刃劍”，在不同的病理情況下其發(fā)揮作用也不同。在腦缺血/再灌注大鼠模型中，重度高血糖抑制線粒體自噬水平，導致受損線粒體堆積，引發(fā)下游的凋亡反應[8]，此時線粒體自噬發(fā)揮著保護作用。另有研究表明[9]，PD患者腦部解剖發(fā)現(xiàn)自噬泡樣的物質(zhì)出現(xiàn)在多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)。本實驗中發(fā)現(xiàn)，MPP+作用SH-SY5Y細胞24 h后，神經(jīng)細胞數(shù)目明顯減少，細胞活性明顯下降，LDH釋放值明顯增加。細胞內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡，經(jīng)MDC染色為自噬泡。研究還發(fā)現(xiàn)，MPP+能激活細胞內(nèi)線粒體自噬水平，引起神經(jīng)細胞缺失或死亡，提示線粒體自噬在MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中發(fā)揮著損傷作用。最新研究報道，丹皮酚對不同作用下自噬的調(diào)節(jié)機制也截然不同[10-11]。在apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中，丹皮酚通過誘導自噬，抑制平滑肌細胞的增殖；而在動脈粥樣硬化細胞模型中，丹皮酚通過抑制自噬，拮抗氧化低密度脂蛋白誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，預先加入丹皮酚作用后可以逆轉MPP+誘導的線粒體自噬過度激活，保護損傷的神經(jīng)細胞。進一步驗證了不同病理機制下丹皮酚發(fā)揮的作用也不完全相同。

LC3是自噬體膜上的標記蛋白，當細胞內(nèi)自噬被激活時，LC3-Ⅰ轉變成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ的含量與自噬空泡的數(shù)目呈正比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值常用來衡量細胞自噬活性[12]。Beclin-1是形成自噬體的必需分子，與多種蛋白反應調(diào)控自噬體形成與成熟。本研究發(fā)現(xiàn)，1 mmol·L-1MPP+作用SH-SY5Y細胞24 h后，自噬標記蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達均明顯增加，MDC染色顯示，細胞內(nèi)酸性自噬泡數(shù)目明顯增多，經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)存在線粒體自噬現(xiàn)象。丹皮酚干預后，線粒體與溶酶體共定位數(shù)量減少，細胞內(nèi)線粒體自噬活性降低，自噬水平出現(xiàn)下降。

線粒體功能障礙在PD的發(fā)生中至關重要，其正常功能的維持常需關鍵分子——parkin[13]。parkin過表達能夠抑制活性氧(reactive oxidative species, ROS)的生成，阻止線粒體膨脹和細胞色素C的釋放，增強線粒體膜電位和復合物的選擇性表達，在PD的動物模型發(fā)揮保護作用[14]。而在parkin缺陷的小鼠中，細胞氧化應激水平升高，紋狀體分離的線粒體呼吸能力降低[15]。這些研究表明，parkin、線粒體自噬與PD之間存在著緊密的聯(lián)系。本實驗結果顯示，MPP+導致了parkin蛋白的表達水平明顯下調(diào)。細胞內(nèi)下調(diào)的parkin蛋白可能會導致其蛋白E3泛素連接酶功能的改變，導致體內(nèi)錯折疊蛋白積聚，受損線粒體累積。其功能喪失還會引起線粒體自噬調(diào)節(jié)的異常，導致PD[16]。丹皮酚能上調(diào)MPP+誘導的parkin蛋白表達，阻止線粒體自噬應激的發(fā)生，穩(wěn)定線粒體功能，保護神經(jīng)細胞。

通過本實驗，并結合前期研究證實，丹皮酚可能從線粒體途徑保護MPP+損傷的PD細胞模型。一方面，丹皮酚屬于異黃酮類化合物，具有很強的抗氧化性，能降低MPP+誘導的ROS含量，減輕線粒體氧化應激反應，提高MPP+誘導的線粒體自噬對功能失常線粒體的清除，使得細胞內(nèi)各細胞器的功能恢復正常狀態(tài)；另一方面，丹皮酚可能通過抑制MPP+誘導的線粒體自噬應激，穩(wěn)定線粒體自噬水平，保護線粒體功能，阻止后期凋亡的的發(fā)生。然而，丹皮酚增強線粒體自噬對失常細胞器的降解或抑制過度的線粒體自噬發(fā)揮神經(jīng)保護作用尚需深入研究。

本實驗結果提示，MPP+誘導了細胞的損傷，并且激活線粒體自噬，破壞了線粒體自噬的穩(wěn)態(tài)，導致線粒體氧化應激損傷和線粒體功能障礙，實驗中MPP+損傷的SH-SY5Y細胞在24 h發(fā)生了線粒體自噬，當不能正常清除損傷線粒體時，則在48 h發(fā)生凋亡[5]。丹皮酚能抑制MPP+誘導的線粒體自噬，保護神經(jīng)細胞死亡。但丹皮酚是如何調(diào)節(jié)線粒體自噬與細胞凋亡之間的關聯(lián)性而發(fā)揮的神經(jīng)保護作用，有待于進一步研究。

(致謝：本實驗是在安徽中醫(yī)藥大學新安醫(yī)學教育部重點實驗室和科研實驗中心完成，感謝實驗室老師的指導與幫助。)