UPLC法測定參附注射液5種人參皂苷及藥動學(xué)研究?

，蕓霞，， ，，

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗室，省部共建國家重點(diǎn) 實(shí)驗室培育基地，成都 611137)

中藥復(fù)方制劑參附注射液最早見于宋·嚴(yán)用和《濟(jì)生續(xù)方》，由古方參附湯經(jīng)分離提取、滅菌制成[1-2]。作為一種典型的多組分傳統(tǒng)中藥，具有益氣溫陽、以化寒飲、振奮心陽、剛陰救逆、益氣固脫、溫通心脈等多重作用[3]，臨床主要用于陽氣暴脫的厥脫證，如預(yù)防和治療各種心功能衰竭、休克等[4]。

參附注射液在臨床有效，藥理研究報道較多，但藥動學(xué)報道較少，關(guān)于參附注射液在正常和心衰大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)比較未見報道。因此，本研究旨在建立一種高效、靈敏的UPLC法，并用于研究大鼠注射參附注射液后5種主要人參皂苷的藥動學(xué)特征，及比較其在正常和心衰大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)差異，為評價參附注射液在臨床應(yīng)用中的功效和安全性，改善治療方案及進(jìn)一步的科學(xué)研究提供參考。

1 材料

1.1 試劑與試藥

參附注射液(批號131110050，雅安三九藥業(yè)有限公司)；人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd(批號分別為MUST-13041301，MUST-13041201，MUST-13102301，MUST-15011912，MUST-15020910，成都曼斯特生物科技有限公司)；甘草苷(內(nèi)標(biāo)，批號131127，成都克洛瑪生物科技有限公司)；鹽酸普羅帕酮注射液(批號140601，廣州白云山明興制藥有限公司)；色譜乙腈、水(批號分別為CAS75-05-8，138683，美國Fisher公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 動物

SD清潔級大鼠，體質(zhì)量(180～220)g，雌雄各半，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供(批號SYXK 2008-049)并檢疫后用。動物實(shí)驗環(huán)境于成都中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級實(shí)驗室(TCM-2009-315)。

1.3 主要儀器

1260型超高效液相色譜儀(UPLC，美國安捷倫科技有限公司)；十萬分之一電子天平(德國sartorius公司)； KQ-5200E型超聲清洗波器(昆山市超聲儀器有限公司)；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司)；TG16-WS型臺式高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)有限公司)；MD200-1型氮?dú)獯祾邇x(杭州奧盛儀器有限公司)；200，1000 μL移液器等(德國Eppendorf公司)；-80 ℃超低溫冰箱(日本三洋電機(jī)公司)。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18column (4.6×150 mm，5 μm)，流動相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～10 min，19 %～19 % B；10～36 min，19 %～30 % B；36～40 min，30 %～40 % B；40～53 min，40 %～40 % B，流速為0.5 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，分析時間為53 min，后運(yùn)行時間為3 min，柱溫為35 ℃，檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長為203 nm。

2.2 儲備液和標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備 分別精密稱取適量人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd和內(nèi)標(biāo)，用甲醇溶解分別配制成1 250、500、500、125、125 μg·mL-1的對照品儲備液和98 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)，于4 ℃冰箱中冷藏。分別取適量儲備液用流動相(A∶B=81∶19)稀釋為不同濃度的混合標(biāo)液，30 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)。取120 μL空白血漿分別精密加入80 μL混合標(biāo)液，加入10 μL內(nèi)標(biāo)渦旋振蕩30 s，再加入100 μL的10 %氨水，600 μL甲醇，渦旋振蕩5 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液于30 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘渣?00 μL流動相溶解即得混合標(biāo)準(zhǔn)樣品1、2、3、4、5、6、7、8(見表1)。選取3個濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品作為混合質(zhì)控樣品，其中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd的濃度依次為：0.40、0.40、3.20、1.60、1.60 μg·mL-1，3.20、3.20、25.00、10.00、10.00 μg·mL-1，6.40、6.40、50.00、20.00、20.00 μg·mL-1。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd濃度比較(μg/mL)

2.3 血漿樣品處理

取制得的血漿200 μL加入1.5 mL的Eppendorf管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)，渦旋振蕩30 s，再加入100 μL的10 %氨水，600 μL甲醇，渦旋振蕩5 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液于30 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘渣?100 μL的流動相溶解，渦旋振蕩5 min，12 000 r·min-1離心10 min，取10 μL上清液進(jìn)行檢測。

2.4 藥代動力學(xué)研究

按照實(shí)驗室前期已建立的方法制備急性心衰大鼠模型[5-6]，隨機(jī)取6只作為心衰組，另取6只正常大鼠作為正常組，分別對2組大鼠尾靜脈注射1.6 mL參附注射液，然后在給藥后(2、10、20、30、60、120、300、480、720、1 440 min)共10個時間點(diǎn)眼眶內(nèi)眥靜脈取血0.5 mL，于4 ℃ 3 500 r·min-1離心10 min，分離血漿于-80 ℃冷凍保存待測。通過UPLC法測定血藥濃度并繪制藥時曲線。

2.5 藥動學(xué)參數(shù)計算

采用WinNonlin6.3軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)，如達(dá)峰濃度(Cmax)、曲線下面積(AUClast)、分布容積(Vz_F)、清除率(Cl_F)、半衰期(t1/2)、滯留時間(MRTlast)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗，P<0.05或P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性實(shí)驗 圖1顯示，于樣品分析的當(dāng)天，取6個不同來源的大鼠空白血漿制備成3個濃度的混合質(zhì)控樣品，在上述色譜條件下測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd和內(nèi)標(biāo)。結(jié)果，各樣品峰形良好，保留時間分別為35.528、36.064、46.503、47.320、51.006、18.764 min，色譜圖證明沒有內(nèi)源物干擾分析和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測。

3.1.2 線性關(guān)系考察 表2顯示，分別精密吸取“2.2”項下8個標(biāo)準(zhǔn)樣品10 μL在“2.1”項條件下進(jìn)樣，以待測物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比Y為縱坐標(biāo)，以待測物濃度X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計算，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，5種人參皂苷在一定濃度范圍內(nèi)成良好的相關(guān)性。

表2 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd的線性及定量限

注：A.空白血漿；B.空白血漿分別加0.40、0.40、3.20、1.60、1.60、2.31 μg/mL人參皂苷Rg1(2)、Re(3)、Rb1(4)、Rc(5)、Rd(6)和內(nèi)標(biāo)(1)；C.大鼠給藥參附注射液300 min后血漿樣品圖1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd血漿UPLC圖

3.1.3 準(zhǔn)確度、精密度和回收率試驗 取120 μL空白血漿，分別精密加入80 μL質(zhì)控混合標(biāo)液，再加入10 μL內(nèi)標(biāo)，渦旋振蕩30 s，然后加入100 μL的10 %氨水，600 μL甲醇，渦旋振蕩5 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液于30 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘渣加流動相溶解，各濃度平行制?份，測定5種人參皂苷與內(nèi)標(biāo)的峰面積，計算峰面積比為B2。另取120 μL空白血漿加入10 μL內(nèi)標(biāo)，渦旋振蕩30 s，再加入100 μL的10 %氨水，600 μL甲醇，渦旋振蕩5 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液于30 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘渣加流動相溶解，再加?0 μL混合標(biāo)液，配置成3個濃度的混合質(zhì)控樣品各6份，測定人參皂苷與內(nèi)標(biāo)的峰面積，計算峰面積比為B1。用流動相將上述濃度的混合標(biāo)液和內(nèi)標(biāo)溶解稀釋，測定相應(yīng)峰面積，計算峰面積比為B3。以 B2/B1計算回收率，以B3/B1計算基質(zhì)效應(yīng)。

取120 μL空白血漿分別精密加入80 μL質(zhì)控混合標(biāo)液，加入10 μL內(nèi)標(biāo)，制備3個濃度的混合質(zhì)控樣品，各濃度平行制備6份，所有樣品在制備當(dāng)天(第1天)內(nèi)測定5次，在第3、5、7 d測定1次，以幾種人參皂苷的隨行標(biāo)曲計算濃度，考察批內(nèi)、批間精密度，分析測得樣品濃度與實(shí)際樣品濃度接近程度考察準(zhǔn)確度。

表3、4顯示，精密度、準(zhǔn)確度考察RSD均小于15 %，回收率在80 %～105 %范圍內(nèi)，基質(zhì)效應(yīng)在90 %～110 %范圍內(nèi)。結(jié)果表明，本研究采用測定血漿中人參皂苷濃度的分析方法符合要求。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗 表5顯示，按“2.2”項方法制備混合質(zhì)控樣品，分別考察混合質(zhì)控樣品在室溫儲存12 h的短期穩(wěn)定性，在-80 ℃儲存30 d的長期穩(wěn)定性，在4 ℃冰箱儲存24 h處理血漿樣品穩(wěn)定性，在-80 ℃超低溫冰箱3次凍融循環(huán)的穩(wěn)定性，結(jié)果表明在上述條件下血漿樣品均穩(wěn)定。

3.2 藥動學(xué)研究

表6、7顯示，造模后心衰大鼠四肢不溫、尾部發(fā)冷、毛蓬松、呼吸急促或微弱。同時，血流動力學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠左心室平均壓、左心室內(nèi)壓最大上升速率、左心室內(nèi)壓最大下降速率均明顯下降，心率次數(shù)減少，左心室舒張末期壓明顯升高等[7]。參附注射液對大鼠尾靜脈注射后5種人參皂苷的藥動學(xué)參數(shù)。

4 討論

本研究采用精密度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，且經(jīng)方法學(xué)考察符合生物樣品測定要求的UPLC法測定參附注射液中5種人參皂苷成分的含量，測得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd的含量分別為253.05、146.67、399.55、177.13、111.36 μg·mL-1。同時將該方法用于正常和心衰大鼠的藥動學(xué)比較研究。但生物樣品機(jī)制復(fù)雜，處理過程較繁瑣，量少且成分含量低，為提高分析的準(zhǔn)確度，保證分析質(zhì)量，應(yīng)選擇合適的內(nèi)標(biāo)[8]。選擇甘草苷作內(nèi)標(biāo)，峰形較好，保留時間適宜，與其他5種人參皂苷成分有很好的分離度。在預(yù)實(shí)驗中，作者嘗試液-液萃取法和蛋白沉淀法提取人參皂苷。采用乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷等萃取時提取回收率較低；采用乙腈作為沉淀試劑時效果不理想；采用甲醇作為沉淀試劑時效果較好，可均勻去除血漿蛋白。并考察1、3、5倍沉淀試劑的提取效果，結(jié)果表明3倍甲醇作為沉淀試劑時提取回收率最好，雜質(zhì)干擾較小，色譜響應(yīng)較高，基質(zhì)效應(yīng)和回收率符合生物樣品的檢測要求。因此，選用甲醇沉淀蛋白法處理血樣操作簡便，費(fèi)用低，方法可靠。

表3 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd在大鼠血漿中精密度和準(zhǔn)確度比較

表4 人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc和Rd在大鼠血漿中 的回收率和基質(zhì)效應(yīng)[例(%)]

表6 參附注射液對大鼠給藥后人參皂苷Rg1和Re的藥動學(xué)參數(shù)比較

注：與正常組比較:*P<0.05

同時，本研究建立的UPLC法已成功用于參附注射液中5種人參皂苷的藥動學(xué)研究。大鼠靜脈給予參附注射液后，血漿中可檢測到的主要成分為人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd。與正常組比較，給藥后心衰組5種人參皂苷在血漿中的Cmax均升高，AUClast均明顯增加，提示5種人參皂苷在心衰大鼠體內(nèi)的血藥濃度升高，含量明顯增加。且心衰組MRTlast均明顯延長，提示5種人參皂苷在心衰大鼠體內(nèi)的平均滯留時間明顯延長，促進(jìn)其在大鼠體內(nèi)的含量增加，增強(qiáng)了其對心血管的有關(guān)藥理作用。

表5 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd在大鼠 血漿中的穩(wěn)定性比較(RSD %)

表7 參附注射液對大鼠給藥后人參皂苷Rb1、Rc和Rd的藥動學(xué)參數(shù)比較

注：與正常組比較:*P<0.05，**P<0.01

綜上所述，本研究建立了一種簡便、靈敏的UPLC法，可同時定量檢測參附注射液中5種人參皂苷成分，并成功應(yīng)用于研究5種人參皂苷的藥動學(xué)特征及其在正常和心衰大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)差異。