鹿茸蛋白提取物對小鼠心肌缺血損傷的保護作用?

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(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)， 長春 130018； 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心， 北京 100700)

心肌梗死是導(dǎo)致急性死亡的主要原因之一[1]。數(shù)年來，中藥對心血管疾病的防治及治療顯示出良好的前景。鹿茸(Cornu Cervi Pantotrichum)是哺乳動物中惟一具有完全再生能力的附屬器官，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥。《本草經(jīng)疏》記載鹿茸入心包、心、腎、肝經(jīng)，味甘咸溫。鹿茸秉承純陽之實質(zhì)，富含生發(fā)之氣，生精補髓，益氣強智，養(yǎng)血壯陽，強筋健骨，治一切虛損，可用來治療心功能減退、心臟功能減弱等疾病[2]。已有研究證明，鹿茸提取物可提高缺血心肌組織SOD活性，降低MDA含量[3]。鹿茸醇提物有較好的抗心率失常作用，改善左心室的收縮和舒張功能[4]。目前鹿茸蛋白提取物對心肌損傷保護作用研究較少。本實驗從減小心梗面積、挽救瀕死心肌的角度出發(fā)，對鹿茸蛋白提取物治療小鼠心肌缺血的作用進行了研究。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性C57BL/6小鼠70只，體質(zhì)量18～20 g(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，SCXK (京)2012-0001)，飼養(yǎng)于SPF 級動物室。

1.2 儀器試劑

氯沙坦鉀(科素亞K021048)；全自動生化儀(日立7080)；CK Kit(中生北控生物科技有限公司150601)；CK-MB Kit(中生北控生物科技有限公司 150761)；LDH Kit(中生北控生物科技有限公司 140571)；Masson染色試劑盒(索來寶 DC0032-100)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI R215)；真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司FD-1D-50)；自動組織脫水機(Thermo Pathcentre)；組織包埋機(Histostar)；全自動石蠟切片機(Finesse ME+)；自動蓋片機(ClearVue)；電子顯微鏡(Olympus BX51)。

2 方法

2.1 小鼠心梗模型制備

參照文獻[5]小鼠稱重后，腹腔注射4%水合氯醛(100 g/mL)麻醉后結(jié)扎左冠狀動脈。對比手術(shù)前后心電圖有典型心梗表現(xiàn)者視為手術(shù)成功。存活動物納入模型組，假手術(shù)組同法手術(shù)但不結(jié)扎冠狀動脈[5]。

2.2 實驗藥物制備

鹿茸蛋白提取物的提取方法詳見本實驗室前期研究[6]。將新鮮鹿茸超微粉碎成肉糜狀后加入一定的冰醋酸浸泡過夜，離心、旋蒸、透析、凍干得到鹿茸蛋白提取物干粉，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 分組與給藥

冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后24 h，選取手術(shù)成功的動物60只，隨機分為假手術(shù)組、模型組、氯沙坦鉀陽性對照組(50 mg/kg)、鹿茸蛋白提取物低、中、高劑量組(60、120、180 mg/kg)6組各10只。各組動物灌胃給藥，連續(xù)給藥14 d，假手術(shù)組和模型組給予同體積生理鹽水。

2.4 小鼠心電圖檢測與心肌N-BT染色

觀察給藥前及給藥14 d后小鼠心電圖ST段平均偏移的值，計算每組動物 ST 段偏移的總毫米數(shù)(Σ-ST)，給藥前后Σ- ST 的差值表示心肌損傷的程度。摘取小鼠心臟速凍后，冠狀方向?qū)⒆笮氖仪谐?0.1 cm 厚的心肌片約5片，放入0.1%的硝基四氮唑藍(N-BT)中，在 37 ℃二氧化碳孵育箱中溫育。數(shù)碼相機拍照后，醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)掃描每片心肌的總面積和梗死區(qū)面積，累積計算心肌總梗死面積占整個心肌總面積的百分比。

2.5 病理學(xué)檢測

取完整心臟組織，將其放入4%多聚甲醛中固定24 h后進行石蠟包埋。沿心尖連續(xù)做冠狀切片，厚度為6 μm。將制作好的片子用HE染色與MASSON染色后，于顯微鏡下觀察心肌梗死形態(tài)與纖維化情況并拍照。

2.6 小鼠心肌組織與血清中心肌酶含量檢測

取心尖部組織以1∶9的比例加入冰生理鹽水，用高速組織勻漿機制成10% 的心肌組織勻漿，低溫離心(3000 r/min，10 min)取上清，用生化儀檢測組織及腹主動脈取血后血清中的心肌酶(CK、K-MB與LDH)含量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 小鼠心電圖檢測與心肌N-BT染色結(jié)果

表1顯示，與假手術(shù)組比較模型組小鼠的心電圖ST段偏移明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，鹿茸低中高劑量組ST段偏移減小，心肌梗死面積明顯減少，梗死區(qū)/心肌百分率降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，陽性藥氯沙坦鉀組小鼠的心電圖ST段偏移減小，其作用較鹿茸高、中劑量組差(P<0.05)，但降低梗死區(qū)/心肌百分率較鹿茸組差異顯著，作用效果更好(P<0.05)。

表1 小鼠心電圖ST段偏移、心肌N-BT 染色結(jié)果及MASSON染色心肌纖維化面積

注： 與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01；與陽性藥組比較:#P< 0.05

3.2 病理檢測結(jié)果

圖1顯示，假手術(shù)組心肌著色均勻，橫紋排列整齊，細胞界限清晰，肌絲無斷裂，可見少量炎性細胞浸潤。模型組心肌梗死區(qū)面積大，梗死區(qū)室壁變薄，如箭頭所示心肌纖維呈波浪狀，纖維肌漿凝聚，形成紅染粗細不一的橫帶，心肌輪廓可見，交界處呈充血狀，可見大量炎性細胞浸潤。與假手術(shù)組比較，PAEs低、中劑量組心肌細胞排列較紊亂，炎癥細胞浸潤降低，高劑量組可見肌漿凝聚呈嗜酸性染色，未見明顯排列紊亂的心肌細胞。氯沙坦鉀組心肌細胞排列紊亂，大部分心肌組織可見強嗜酸性染色。

圖2顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心肌梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)可見纖維增生和排列紊亂；與模型組比較，氯沙坦鉀組、鹿茸高、中、低劑量組未見明顯梗死區(qū)，心肌纖維化沉積減少。表1顯示，各組小鼠心肌纖維化面積與模型組比較，鹿茸高、中、低劑量組、氯沙坦鉀組心肌纖維化面積明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；鹿茸組與陽性藥氯沙坦鉀組比較，陽性藥組減少心肌纖維化面積顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：A.Sham；B.Model；C.PAEs-L；D.PAEs-M；E.PAEs-H； F.Losartan(箭頭所指為排列紊亂的心肌纖維)圖1 各組小鼠心尖部分心肌組織HE染色(×40倍， 局部放大×200倍)

注：A.Sham；B.Model；C.PAEs-L；D.PAEs-M；E.PAEs-H； F.Losartan(箭頭所指為心肌纖維化沉積區(qū))圖2 各組小鼠心尖部分心肌組織MASSON染色(×40倍， 局部放大×200倍)

3.3 小鼠心肌組織與血清中心肌酶含量

表3顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心肌組織中的CK、CK-MB、LDH含量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)；與模型組比較，鹿茸高、中低劑量組均能顯著降低心肌組織中的CK、LDH含量(P<0.05,P<0.01)，氯沙坦鉀組對心肌組織CK、CK-MB含量無顯著影響；與陽性藥氯沙坦鉀組比較，鹿茸高劑量組對CK含量降低顯著(P<0.05)。血清中心肌酶含量與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清中的LDH含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，鹿茸高、中、低劑量組和氯沙坦鉀組均能顯著降低血清中LDH含量(P<0.05,P<0.01)；對血清心肌酶指標(biāo)CK、CK-MB檢測結(jié)果顯示，模型組與各給藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可能與檢測時間為給藥14 d后心肌酶緩慢回落有關(guān)。

表3 心肌組織和血清中心肌酶含量比較

注：與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01；與陽性藥組比較:#P< 0.05

4 討論

急性心肌梗死為臨床一類常見心血管疾病，發(fā)病原因和心肌收縮力、心肌缺血梗死、心肌收縮不協(xié)調(diào)等密切相關(guān)，發(fā)病率為32%～58%[7]。因此，選擇藥物治療的原則應(yīng)包括保護和維持心臟功能，挽救瀕死的心肌，防止梗死區(qū)擴大，縮小心肌缺血范圍，及時處理嚴重的心律失常、泵衰竭和各種并發(fā)癥，防止猝死，使患者不但能渡過急性期，且康復(fù)后還能保持盡可能多的功能心肌，最重要的是極大可能地降低毒副作用，保證用藥安全[8]。

鹿茸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為中品，是我國的傳統(tǒng)名貴中藥之一。鹿茸具有完全再生能力，在其生長期間以每天2 cm的速度生長而不會形成腫瘤，因此我們推測鹿茸中含有促進組織再生的物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理研究證實，鹿茸中蛋白類成分高達55.26%，但鹿茸蛋白對受損心肌的保護作用研究較少。本實驗證明，我們所提取的鹿茸蛋白提取物為60、120、180 mg/kg時可改善心電圖損傷變化，抑制S-T段的變異率，減小心肌梗死面積，降低心肌纖維化程度，提示鹿茸蛋白提取物對小鼠心肌缺血損傷具有保護作用。

心臟損傷的血生化標(biāo)志物檢測值異常是心肌梗死的重要診斷標(biāo)準(zhǔn)，一直受到臨床的重視。CK、CK-MB、LDH被認為是心肌細胞受損程度的重要標(biāo)志酶[9]。當(dāng)冠狀動脈供血急劇減少，相應(yīng)的心肌組織由于缺血導(dǎo)致梗死，促使大量的心肌酶因心肌細胞梗死時進入血液，血液中相應(yīng)的心肌酶含量明顯升高[10]。其中CK、CK-MB在急性心梗發(fā)作時出現(xiàn)早(3～8 h)，達峰值時間短(10～36 h)，恢復(fù)時間快(72～80 h)。LDH在急性心梗發(fā)作時出現(xiàn)較晚(8～18 h)，達峰值時間24～72 h，恢復(fù)時間長(6～10 d)。心肌梗死后能量代謝途徑改變，而作為參與有氧代謝過程的LDH廣泛地存在于心肌細胞質(zhì)中,使乳酸變?yōu)楸岫M入檸檬酸循環(huán)提供能源。因此，LDH活性的強弱可以反映心肌細胞有氧代謝功能的強弱[11]。本實驗證明，鹿茸蛋白提取物120、180 mg/kg能明顯降低心肌缺血損傷小鼠心肌組織CK、CK-MB、LDH與血清LDH的含量，提示口服PAEs后可能通過改善缺血區(qū)能量代謝而達到保護心肌損傷的作用。但對于血清CK、CK-MB的含量無顯著性改變，可能與檢測時間為給藥14 d后心肌酶緩慢回落有關(guān)。

氯沙坦鉀屬于血管緊張素Ⅱ(AngⅡ) 受體拮抗劑，具有減少心肌梗死后心肌間質(zhì)膠原沉積、改善心肌血流灌注、抑制心梗后心肌質(zhì)量增加的作用[12]。本實驗結(jié)果表明，氯沙坦鉀可顯著降低心肌纖維化面積，但對于心梗面積、心肌組織CK、CK-MB、LDH的改善作用弱于鹿茸高劑量(180 mg/kg)組。

鹿茸在我國吉林省資源豐富，因其毒副作用少、療效好，適于長期用藥。目前的實驗和臨床研究表明，應(yīng)用心肌保護劑能明顯降低人、動物的心肌梗死范圍，減輕心肌損傷程度。鹿茸蛋白提取物經(jīng)口服后仍具有上述的心肌損傷保護作用，可為開發(fā)心肌保護用藥提供思路。下一步的工作中，我們將對鹿茸蛋白與心肌缺血保護相關(guān)的信號通路進行深入研究，為鹿茸產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)。