二陳湯合桃紅四物湯對ApoE基因敲除動脈粥樣硬化 小鼠作用及機制研究?

，，， ， ，，楊關(guān)

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)性改變是動脈硬化類血管病中最常見、最重要的一種病變，血管內(nèi)粥樣斑塊脫落是導(dǎo)致心腦血管臨床不良事件發(fā)生的主要原因[1]。中醫(yī)學(xué)并沒有AS這一病名，因其多由高脂血癥導(dǎo)致或多以冠心病、腦血管疾病等誘因，以及臨床表現(xiàn)和并發(fā)癥等特征，現(xiàn)代醫(yī)家多將其歸屬于“痰濁”“血瘀”等研究范疇，認為脾虛痰濁內(nèi)生、瘀血阻滯、痰瘀互結(jié)是導(dǎo)致本病發(fā)生的主要病機[2]?；贏S的發(fā)病機制及臨床表現(xiàn)，臨床多采用益氣、健脾、化瘀、祛痰等方法進行辨證論治。本研究根據(jù)“活血化瘀”“健脾化痰”等治療理論，選取二陳湯合桃紅四物湯干預(yù)ApoE基因敲除AS小鼠，對二陳湯合桃紅四物湯干預(yù)ApoE基因敲除AS小鼠的作用及抗AS作用等相關(guān)機制進行研究。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級ApoE-/-小鼠50只，同齡具有相同遺傳背景的C57BL/6 J小鼠10只，體質(zhì)量18～22 g，8周齡，全部小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證號SCXK(京)2012-0001)，雌雄各半。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物中心，自由攝食與飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22±2 ℃，相對濕度40%～45%。

1.2 藥材與試劑

二陳湯組成：半夏15 g，陳皮15 g，茯苓12 g，甘草6 g。桃紅四物湯組成：桃仁12 g，紅花9 g，當(dāng)歸12 g，川芎9 g，赤芍9 g，生地12 g。全部藥物購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。全部藥物加水浸泡1 h后，先武火煎煮沸騰后調(diào)至文火煎煮，每份藥物煎煮3次，混合后濃縮為分別含有生藥量為0.72、1.44、2.89 g/mL的煎劑。血脂康膠囊購自北京北大維信生物科技有限公司(國藥準(zhǔn)字Z10950029)，用蒸餾水配制成藥物濃度為0.0078 g/mL的水溶液。

VEGF、TNF-α Elisa試劑盒，購自達科為生物科技有限公司； TGF-β、PI3K、AKT、p-AKT、eNOS、β-actin、二抗購自美國CST公司；p-eNOS抗體購自愛必信生物科技有限公司；血脂檢測試劑盒購自四川邁克生物科技有限公司；NO、ET-1Elisa試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TRIZOL試劑(Invitrogen)；氯仿(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；異丙醇(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)。

1.3 儀器

酶標(biāo)儀(美國Thermo)，全自動生化分析儀(日本東芝)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能)；7500 Real Time PCR儀(美國Applied Biosystems)；普通光學(xué)顯微鏡(德國Leica)；組織包埋機、石蠟切片機(德國Leica)。

2 方法

2.1 動物分組及處理

10只C57BL/6 J小鼠做空白對照組，給予普通小鼠維持飼料喂養(yǎng)，50只ApoE-/-小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組和陽性對照組各10只，雌雄各半，給予高脂飼料喂養(yǎng)進行模型復(fù)制，飼養(yǎng)12周。于第9周開始，中藥低、中、高劑量組分別給予含有生藥量為0.72 g/mL、1.44 g/mL、2.89 g/mL的中藥煎劑灌胃，陽性對照組給予濃度0.0078 g/mL的血脂康膠囊水溶液灌胃，每次0.2 mL，每日早晚各1次，正常組和模型組給予等體積蒸餾水進行灌胃。于12周末禁食禁水24 h后，分離血清、腹主動脈至胸主動脈，分別保存于-80 ℃超低溫冰箱和4%多聚甲醛中備用。

2.2 檢測指標(biāo)及方法

2.2.1 血清膽固醇水平檢測 采用全自動生化分析儀檢測2組小鼠血清中TC、 TG、HDL、LDL。

2.2.2 主動脈組織形態(tài)學(xué)檢測 取出4%多聚甲醛溶液中固定的主動脈標(biāo)本，按蘇木素-伊紅(HE)染色常規(guī)方法進行。水洗12 h后，70%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，按4 μm厚度切片、貼片、烤片后，用二甲苯脫蠟、70%～100%梯度酒精復(fù)水、蘇木精染色、70%鹽酸酒精分色，伊紅復(fù)染后再用70%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片石蠟包埋，光學(xué)顯微鏡下觀察冠脈組織形態(tài)。

2.2.3 血清TNF-α、IL-6、NO、ET-1水平檢測 采用Elisa法檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-6、NO、ET-1水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.2.4 Western blot法檢測各組小鼠主動脈TGF-β、PI3K、AKT、eNOS蛋白表達水平 加入蛋白裂解液提取總蛋白，Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒進行蛋白定量。每泳道上樣蛋白50 μg，SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，加入1∶1000兔抗小鼠 TGF-β、PI3K、AKT、p-AKT、eNOS、p-eNOS、β-actin，4 ℃封閉過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，1 h后TBST洗滌3次，每次10 min，按試劑盒說明書混合發(fā)光液A和B，與膜作用5 min后，使用天能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠血脂水平變化

表1顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL水平顯著升高(P<0.01)，HDL水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組以及陽性對照組TC、TG、LDL水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)，HDL水平顯著升高(P<0.01)。

3.2 主動脈組織形態(tài)學(xué)變化

圖1顯示，HE染色與空白對照組比較，模型組小鼠主動脈有較大斑塊形成，與模型組比較各治療組斑塊情況有不同程度改變，以中藥高劑量和陽性對照組效果較佳。

3.3 血清相關(guān)指標(biāo)水平變化

表2顯示，與空白對照組比較，模型組TNF-α、IL-6、ET-1水平顯著升高(P<0.01)，NO水平顯著降低(P<0.01)，NO/ET-1水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較各治療組TNF-α、IL-6、ET-1、NO水平顯著改善，NO/ET-1水平顯著升高，以中藥高劑量和陽性對照組效果較為明顯。

表1 各組小鼠血脂變化情況

注：與空白對照組比較:**P<0.01；與模型組比較:ρP<0.05，ρρP<0.01；與陽性對照組比較:πP<0.05，ππP<0.01

表2 血清相關(guān)指標(biāo)水平變化比較

注：與空白對照組比較:**P<0.01；與模型組比較:ρP<0.05，ρρP<0.01；與陽性對照組比較:πP<0.05，ππP<0.01

圖1 各組小鼠主動脈組織形態(tài)學(xué)變化(100×)

3.4 各組小鼠主動脈TGF-β、PI3K、AKT、eNOS蛋白表達情況

圖2顯示，Western blot檢測主動脈蛋白表達結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠主動脈TGF-β、PI3K蛋白表達水平和AKT、eNOS蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，各治療組小鼠主動脈TGF-β、PI3K蛋白表達水平和AKT、eNOS蛋白磷酸化水平有不同程度改善，以中藥中劑量組、中藥高劑量組、陽性對照組(P<0.05或P<0.01)效果較為明顯。

注：與空白對照組比較：**P<0.01；與模型組比較:ρP<0.05，ρρP<0.01；與陽性對照組比較:πP<0.05，ππP<0.01圖2 各組小鼠主動脈相關(guān)蛋白表達比較

4 討論

二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，由半夏、陳皮、茯苓、甘草、生姜、烏梅6味藥物組成，后世醫(yī)家在此基礎(chǔ)上進行加減化裁形成了諸多二陳湯類方。本方藥物多為辛甘苦味藥，大多入脾經(jīng)，具有燥濕化痰、理氣健脾之功。諸多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，二陳湯具有降血脂的作用，為其健脾化痰作用的主要表現(xiàn)[3-4]。桃紅四物湯出自《醫(yī)宗金鑒》，由桃仁、紅花和地黃、芍藥、當(dāng)歸、川芎組成，具有養(yǎng)血活血祛瘀功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯具有降血脂、抗氧化、促進血管新生等作用[5-6]。本研究基于AS“痰瘀致病”理論，探討二陳湯合桃紅四物湯對ApoE-/-AS小鼠的作用及作用機制，為痰瘀論治AS提供理論基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠高脂飲食12周后，血脂水平明顯異常，主要表現(xiàn)為血清TC、TG、HDL水平明顯升高，LDL水平明顯降低，腹主動脈HE染色可發(fā)現(xiàn)有明顯的AS斑塊形成，血清TNF-α、IL-6水平顯著升高，ET-1水平顯著升高，NO水平顯著降低，NO/ET-1水平顯著降低。與模型組小鼠比較，各治療組在第9周給予對應(yīng)藥物治療，治療4周后發(fā)現(xiàn)各治療組血脂水平異常得到明顯恢復(fù)，AS程度得到明顯改善，血清TNF-α、IL-6水平顯著降低，NO、ET-1水平顯著改善，NO/ET-1水平顯著升高。表明二陳湯合桃紅四物湯能有效改善ApoE-/-AS小鼠血脂異常、炎癥反應(yīng)、氧化損傷合斑塊形成等，對AS的治療具有積極作用。

AS的發(fā)生是一個復(fù)雜的慢性炎癥反應(yīng)過程，其發(fā)生早期主要為脂質(zhì)聚集在血管內(nèi)膜，在相關(guān)炎癥因子刺激下，單核細胞分化成巨噬細胞，巨噬細胞吞噬脂滴形成泡沫細胞集聚，逐漸發(fā)展為斑塊[7]。轉(zhuǎn)化生子因子β(transforming growth factor Beta，TGF-β)在AS發(fā)生發(fā)展的進程中具有重要作用，研究表明，病變早期TGF-β具有抗炎、抗氧化損傷的作用，能夠抑制血管平滑肌的增生。但在病變晚期，TGF-β則能促進血管平滑肌增生和血管纖維化，加速斑塊的形成[8-9]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是TGFβ的重要下游基因，TGFβ能激活下游PI3K/AKT信號通路的表達[10]；NO主要在PI3K/AKT信號通路重要的下游基因內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化作用下由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，當(dāng)體內(nèi)的NO下降時，會使血管內(nèi)皮功能紊亂，在AS的發(fā)病進程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，PI3K/AKT/eNOS信號通路在AS中起重要作用[11-12]。

本研究通過檢測TGF-β、PI3K、AKT、eNOS等mRNA和蛋白水平，探討二陳湯和桃紅四物湯抗AS作用的可能機制。結(jié)果表明，模型組小鼠主動脈TGF-β、PI3K mRNA和蛋白水平表達顯著升高，AKT、eNOS蛋白磷酸化水平顯著升高，經(jīng)過二陳湯合桃紅四物湯治療后，TGF-β、PI3K mRNA和蛋白水平表達顯著降低，AKT、eNOS蛋白磷酸化水平顯著降低，以中藥中、高劑量組效果較為明顯。

綜上所述，本研究認為二陳湯合桃紅四物湯具有良好的抗AS作用，其機制可能是通過激活TGF-β/PI3K/AKT/eNOS信號通路實現(xiàn)，本研究小組也將在體外實驗研究中進一步深入研究。