一例豬圓環(huán)病毒2型與副豬嗜血桿菌混合感染的診斷

馬梓承 李 焱 曹 龍 焦秋林 劉照虎 王宏宇 孟凡亮 劉思當,2,3*

（1山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271000；2山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，山東泰安 271018；3山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，山東泰安 271018）

目前豬圓環(huán)病毒共有3個血清型，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV2為豬群主要致病性病毒，也是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）和皮炎與腎病綜合征（PNDS）的主要病原。主要引起豬只皮膚蒼白，被毛蓬亂，呼吸困難，體表淺淋巴結(jié)特別是腹股溝淺淋巴結(jié)腫大，豬群漸進性消瘦或生長遲緩。且所引起的免疫抑制更是困擾豬場的一大亟待解決的難題[1-3]。

副豬嗜血桿菌病目前是嚴重危害中國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)的重要細菌病之一。最近幾年，由于中國人口眾多，對豬肉食品的高度需要，加上養(yǎng)殖戶為了謀求更大的利益，導致保育圈舍的飼養(yǎng)密度越來越大，豬群越來越不安全，副豬嗜血桿菌感染在保育仔豬階段呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢[4]。當豬群感染病毒性疾病后，機體抵抗力下降，此時包括副豬嗜血桿菌在內(nèi)的細菌病便會“乘虛而入”，使得機體在患病毒病的同時繼發(fā)感染細菌病，加重了動物病情，引起動物最終死亡。據(jù)臨床病料信息統(tǒng)計，藍耳病病毒和圓環(huán)病毒與副豬嗜血桿菌混合感染的比例最高。但是隨著豬只日齡的逐漸增長，抗生素對于副豬嗜血桿菌的療效越來越弱，所以早期針對病毒性疾病的完善的免疫流程和合理的藥物防治顯得尤為重要[5]。為研究和探尋副豬嗜血桿菌病的正確防治流程，現(xiàn)介紹1例山東泰安地區(qū)某規(guī)?；i場副豬嗜血桿菌病典型病例的診斷與防治。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病背景

山東泰安某豬場現(xiàn)有存欄母豬50頭、保育豬280頭。2018年6月該豬場40余頭50日齡左右的保育豬出現(xiàn)高熱（39.5～41.5℃），精神沉郁，部分病豬體表被毛粗亂；采食量顯著下降，伴有明顯的呼吸困難綜合征。對病豬注射青霉素，使用包被的恩諾沙星拌料，但效果不理想；發(fā)病豬死亡周期較長，一般在7～10 d；隨著疫情逐步擴大，1周后保育舍發(fā)病率高達60%，死亡率達40%，遂前來就診。該豬場免疫程序為：仔豬2日齡滴鼻偽狂犬病疫苗，20日齡免疫豬藍耳病疫苗，28日齡免疫豬瘟疫苗。另了解豬群日常保健不良，病豬曾用恩諾沙星，然而死亡率并未下降。

1.2 主要儀器及試劑

TaqDNA聚合酶，DNA Marker DL 2 000，購自大連寶生物工程有限公司；TSA培養(yǎng)基，TSB培養(yǎng)基，購自美國BD公司；DNA/RNA Kit，Easy Script One-Step RT-PCR Super Mix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 送診病豬臨床癥狀

病豬精神萎靡，不愿走動；呼吸急促，頻率快，伴有間歇性咳嗽癥狀；腹股溝淋巴結(jié)腫大異常；高熱，體溫在41℃左右；呼吸困難，黏膜發(fā)紺，體態(tài)虛弱。

1.4 剖檢變化和樣品采集

對送檢病豬采取頸動脈放血致死，剖檢發(fā)現(xiàn)病死豬胸腔、腹腔、肺臟、心臟、肝臟、脾臟等器官表面有大量纖維素性滲出物，并造成不同程度的黏連；心包積液、心臟外側(cè)充滿纖維素性滲出物；肺臟間葉、心葉嚴重實變，手觸如橡皮一般，內(nèi)部氣體充盈，切面濕潤，有漿液滲出，呈典型“橡皮肺”；全身淋巴結(jié)腫大，腹股溝淋巴結(jié)腫大，最為突出；肝臟質(zhì)硬易碎，色澤暗淡，無血色，布滿白斑；脾臟表面布滿丘陵狀出血疹；雙腎均見明顯的白色斑點狀壞死灶（圖1）。

1.5 病料處理

各取少量凍存的脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、肝臟等組織，放入研磨器中，加入1 mL滅菌PBS，將研磨后產(chǎn)物轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中。在－80℃冰箱中反復凍溶3次后，12 000 r/min離心7 min，將上清吸入1.5 mL滅菌離心管中，備用。使用北京全式金EasyPure ViralDNA/RNA kit（批號：L41228）提取病毒核酸，整個操作流程嚴格按照試劑盒說明書進行。

圖1 病豬脾臟、腹腔、胸腔、肺臟、肝臟、腎臟等器官病變圖

1.6 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI上已發(fā)表的豬瘟病毒（CSFV）、藍耳病病毒（PRRSV）、偽狂犬病病毒（PRV）、PCV2經(jīng)典毒株的保守基因序列設(shè)計特異性引物（表1）。

表1PCR/RT-PCRR引物序列

2 結(jié)果

2.1 病毒RT-PCR檢測結(jié)果

通過PCR/RT-PCR方法擴增后，將擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，根據(jù)紫外凝膠成像儀下具體條帶位置判定病豬的病原感染狀況（圖2），可知病豬僅感染PCV2，未檢出其他病毒。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 細菌分離鑒定

取新鮮肺臟，劃線接種于含有10%新生犢牛血清和20 g/mL NAD的TSA培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24～48 h后挑取疑似菌落進行傳代純化，純化培養(yǎng)后24～48 h可見針尖大小的無色透明且光滑濕潤的菌落。革蘭氏染色后顯微鏡鏡檢可見，呈革蘭氏陰性桿菌，具有多種形態(tài)，從短桿狀、細長桿狀到長絲狀不等，其中大多數(shù)細菌呈略微彎曲的桿狀（圖3）。

圖3 革蘭氏染色鏡檢

2.3 生化鑒定

將分離純化得到的疑似菌落分別接種于木糖、觸酶、氧化酶、吲哚、硝酸鹽、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露醇、脲酶微量生化鑒定管中，每支生化管中加入1 μL犢牛血清和1 μL NAD的（V因子），于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。其中甘露醇、木糖、脲酶、氧化酶、H2S、吲哚反應呈陰性，蔗糖、葡萄糖、果糖、觸酶、半乳糖、硝酸鹽反應呈陽性（表2），符合副豬嗜血桿菌生化特性。

表2 生化特性培養(yǎng)結(jié)果

2.4 細菌PCR鑒定結(jié)果

取提純后細菌菌液進行PCR檢測，經(jīng)PCR方法擴增后，將擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，可見在821 bp的位置出現(xiàn)了與副豬嗜血桿菌陽性對照相同的條帶（圖 4）。

圖4 瓊脂糖凝膠電泳圖 （副豬嗜血桿菌）

2.5 病理組織學診斷

病理組織學變化見圖5，脾臟可見炎性細胞浸潤，細胞壞死，視野中充滿大量紅細胞（圖5A）；腎臟間質(zhì)出血，炎性細胞增生，呈間質(zhì)性腎炎病變（圖5B）；腹股溝淋巴結(jié)可見炎性細胞浸潤，充滿大量嗜中性粒細胞，且伴有大量紅細胞（圖5C）；心外膜纖維化，心肌炎性細胞增生，間質(zhì)充血出血，呈間質(zhì)性心肌炎病變（圖5D）；肝臟鏡下可見巨噬細胞增生，嗜中性粒細胞增生（圖5E）；肺臟可見細支氣管充滿炎性細胞，以嗜中性粒細胞居多，化膿性支氣管炎，間質(zhì)性肺炎；肺泡腔內(nèi)漿液性滲出，肺泡間質(zhì)輕微充血、出血（圖5F）。

3 討論與防治

根據(jù)臨床病例剖檢、實驗室檢測及組織病理學觀察結(jié)果分析，該場大規(guī)模豬群死亡是因感染PCV2導致機體免疫力下降，后繼發(fā)副豬嗜血桿菌病。確診后，及時調(diào)整豬場的免疫程序，對未發(fā)病豬群緊急補免PCV2疫苗。采用氟苯尼考和黃芪多糖拌料防治，對于發(fā)病嚴重豬，單獨注射恩諾沙星針劑，連用1周，及時控制了該場的疫情蔓延，減少了經(jīng)濟損失。

研究發(fā)現(xiàn)各地分離到的副豬嗜血桿菌的血清型復雜多樣，根據(jù)Kieletein-Rapp-Gabriedson瓊脂擴散血清分型方法，至少可將副豬嗜血桿菌分為15個血清型，另有20%以上的分離株不能定型，各型之間交叉保護力弱[6]。當發(fā)生副豬嗜血桿菌感染時，應及時到相應實驗室進行檢測，進行細菌分離及血清分型鑒定，通過流行病學調(diào)查的方法及時明確豬場流行的主要血清型，以便選用合適的疫苗進行補免，對病情較重的豬場應結(jié)合抗生素進行防治。然而隨著抗生素的大量使用，副豬嗜血桿菌對常用抗生素的耐藥性越來越高，采用輪轉(zhuǎn)用藥、交替用藥可以顯著降低副豬嗜血桿菌的耐藥性。而不同地區(qū)的副豬嗜血桿菌對藥物敏感性各不相同，因此藥敏試驗是篩查敏感藥物的一項重要舉措。

由于PCV2致死率較低，為節(jié)省治療成本，大多數(shù)養(yǎng)豬場總是抱著無所謂的態(tài)度，選擇不免疫PCV2疫苗，將資金著重用于豬瘟、偽狂犬病、藍耳病等高致死性病毒病的免疫。這可能造成PCV2在場內(nèi)瘋狂傳播。如果單是感染圓環(huán)病毒病，成年豬尚可以耐過，但患病期間，整個豬群免疫力急劇下降，非常容易混合或繼發(fā)感染病毒病及其他細菌病，造成巨大的經(jīng)濟損失；而且PCV2具有免疫抑制性，當機體內(nèi)存在此病原時，免疫抗體水平有可能根本無法達到理想的保護水平，給豬場帶來極大的安全隱患[7]。

圖5 組織病理學切片觀察

3.1 隔離淘汰病豬

為避免交叉感染，對于發(fā)病的豬只應立即隔離，對發(fā)病嚴重的豬應及時淘汰。

3.2 飼養(yǎng)管理

加強飼養(yǎng)管理，降低養(yǎng)殖密度，加強通風，提高豬舍空氣質(zhì)量[8]；及時清理動物糞便，保持圈舍干燥清潔；加強豬場的衛(wèi)生消毒，對于外來進場人員一定要先進行隔離，在轉(zhuǎn)群空舍時用高錳酸鉀等消毒液對豬場進行全面的消毒，加強對料槽和水槽等用具的衛(wèi)生保潔工作。

3.3 治療

病程發(fā)展前期，可用阿莫西林、強力霉素各100 g混合600 kg飼料；中期可用20%氟苯尼考100 g、磺胺六甲氧嘧啶100 g混合200 kg飼料，連續(xù)投喂1周；后期應考慮耐藥性因素，避開平時常喂藥物，減少細菌抗藥性。將500 g電解多維和100 g阿莫西林混合500 kg水，100 g利巴韋林、200 g磺胺六甲氧嘧啶、180 g多西環(huán)素混合在飼料中，投喂豬群1周。在即將痊愈的康復期內(nèi)，合理添加黃芪多糖，提高豬群的免疫力。

3.4 藥物預防保健

3.4.1種豬藥物預防程序

⑴母豬產(chǎn)前產(chǎn)后5 d：阿莫西林日劑量按體重20～40 mg/kg，或?qū)㈩^孢拉定按照3位成年人的劑量給豬拌料飼喂，防治乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎、產(chǎn)后熱，若母豬產(chǎn)后發(fā)熱較嚴重，可注射頭孢噻呋；

⑵母豬斷奶前后5 d：包被恩諾沙星20 g/100 kg拌料，防治乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎及斷奶應激反應。

3.4.2 自繁自養(yǎng)仔豬藥物預防程序

⑴出生后1～3 d：頭孢噻呋鈉0.5 g/窩/天，肌肉注射1次，防治黃痢、臍炎及皮膚感染，并注射補鐵針劑1次；

⑵出生后8～12 d：硫酸新霉素0.2 g/天/頭，水溶解噴灑誘食料飼喂或飲水，預防白?。?/p>

⑶斷奶前后5 d：強力霉素20 g/100 kg飼料，拌料或水溶解噴灑顆粒料，預防氣喘病、副豬嗜血桿菌病、附紅細胞體病等各種細菌感染；

⑷斷奶后11～15 d：包被恩諾沙星20 g/100 kg飼料，拌料，預防氣喘病、副豬嗜血桿菌??；

⑸斷奶后21～24 d：氟苯尼考20 g/100 kg拌料，或水溶解噴灑顆粒料，預防氣喘病、副豬嗜血桿菌病等各種細菌感染；

⑹斷奶后31～35 d：泰樂菌素、新霉素各20 g/100 kg拌料，或水溶解噴灑顆粒料，預防氣喘病、回腸炎；

⑺去勢、免疫、換料、轉(zhuǎn)群等：土霉素0.2%拌料，連用5 d，預防氣喘病、附紅細胞體病及各種細菌感染。