轉(zhuǎn)基因動物制備方法

華再東 任紅艷 鄭新民

（1動物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；2湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430064）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是分子生物學(xué)技術(shù)的拓展，是現(xiàn)代探索生命科學(xué)奧秘的有效工具，是推動人類社會進(jìn)步的偉大技術(shù)。就目前形勢來看，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)滲透到我們生活的各個(gè)方面，如疾病治療、疫苗生產(chǎn)、制藥、環(huán)境衛(wèi)生、農(nóng)作物、食品加工等多個(gè)領(lǐng)域，具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會意義。

就制備歷程來看，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展主要經(jīng)歷了采用顯微注射法及病毒載體法制備轉(zhuǎn)基因動物和基于體細(xì)胞克隆為核心技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因家畜。關(guān)于動物的轉(zhuǎn)基因方法，最早是利用胚胎感染反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)移，獲得了世界首例轉(zhuǎn)基因動物。之后通過顯微操作將外源基因注射到小鼠胚胎，獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。1982年，Palmiter等[1]將含有大鼠生長激素的結(jié)構(gòu)基因與小鼠的金屬硫-Ⅰ基因啟動子相連，再利用顯微注射技術(shù)將融合后的DNA片段注射到小鼠卵的原核中，最后成功制備了著名的“超級小鼠”，加速了動物生長方式的研究，為人類研究遺傳疾病和巨人癥建立了動物模型。在此之后，各國科學(xué)家和學(xué)者掀開了對轉(zhuǎn)基因動物研究的序幕，先后在豬、牛、羊等動物身上取得成功。在1997年，Wilmut等[2]通過體細(xì)胞核移植獲得克隆羊，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)又進(jìn)入了新的篇章，為動物生物反應(yīng)器的發(fā)展開拓了新的方向。2017年，世界上首例體細(xì)胞克隆猴“中中”誕生[3]。

在制備轉(zhuǎn)基因動物的過程中，外源基因很容易發(fā)生隨機(jī)打靶，使得目的基因不表達(dá)或低表達(dá)，插入正常基因位點(diǎn)影響正?；虮磉_(dá)等，這些因素很大程度上制約了轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用發(fā)展。為了提高基因編輯的效率，近年來不斷發(fā)展出新的基因編輯技術(shù)，如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等技術(shù)。以下綜述動物轉(zhuǎn)基因應(yīng)用的顯微注射、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、體細(xì)胞核移植、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)和精子介導(dǎo)等方法。

圖1 顯微注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠示意圖

1 顯微注射技術(shù)

顯微注射技術(shù)是指在高倍倒置顯微鏡下，用顯微注射針將外源基因?qū)肱咛セ蚣?xì)胞內(nèi)的一種方法。隨著受精卵的不斷發(fā)育，外源基因被整合到受體基因組中，最后發(fā)育成熟為轉(zhuǎn)基因動物。Gordon等[4]首先采用受精卵原核注射方法，將皰疹病毒基因注射到小鼠原核期胚胎的原核內(nèi)，獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠（圖1）。此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期較短，且導(dǎo)入的外源DNA大小不受限制。但其實(shí)驗(yàn)要求使用精密儀器且價(jià)格昂貴、導(dǎo)入的外源基因拷貝數(shù)不受控制等諸多因素也限制了這一技術(shù)的使用。盡管如此，考慮到直接作用于基因功能，整合效率較為穩(wěn)定，所以這項(xiàng)技術(shù)目前仍是建立轉(zhuǎn)基因動物的常用方法。

2 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法（retrovirus-mediated gene transfer）是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的侵染能力，將外源基因整合到宿主基因組中，經(jīng)重組后制備出轉(zhuǎn)基因動物。逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)又名反轉(zhuǎn)錄病毒，是一組RNA病毒，由于它們在復(fù)制過程中必須經(jīng)過由RNA到DNA這一逆轉(zhuǎn)錄的過程而得名。其種類有很多，如人類免疫缺陷病毒 （HIV）、rous肉瘤病毒（RSV）、禽白血病病毒（ALV）等。1974年，Janenisch等[5]利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法將SV40病毒DNA注入小鼠囊胚腔中，經(jīng)手術(shù)轉(zhuǎn)移至子宮內(nèi)發(fā)育，獲得轉(zhuǎn)SV40基因的小鼠，為腫瘤病毒垂直傳播和表達(dá)實(shí)驗(yàn)提供了新的研究工具。Bosselman等[6]運(yùn)用REV病毒作為載體，然后將GH基因?qū)肱Ｅ咛ブ校晒χ苽淞宿D(zhuǎn)基因牛。逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法已廣泛運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因動物的制備，包括人類遺傳疾病的研究、細(xì)胞功能缺失校正、遺傳物質(zhì)表達(dá)和產(chǎn)物等研究領(lǐng)域。目前，研究結(jié)果表明逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法具有感染效率高、宿主范圍廣等特點(diǎn)。但是慢病毒載體只能攜帶小于10 kb的基因片段，存在致癌的風(fēng)險(xiǎn)，且容易出現(xiàn)嵌合體，因此在實(shí)際應(yīng)用中有一定局限性。

3 體細(xì)胞核移植法

體細(xì)胞核移植技術(shù)先將外源目的基因轉(zhuǎn)染到體細(xì)胞中，使體細(xì)胞在體外培養(yǎng)、傳代，篩選出整合有外源目的基因的體細(xì)胞作為核移植的供體細(xì)胞，然后供體細(xì)胞注射到去核卵母細(xì)胞間隙，再通過人工激活、融合技術(shù)，獲得體外重組胚胎，移植給代孕母畜動物體內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因動物（圖2）。在理論上，出生的個(gè)體100%是陽性動物，而且外源基因的表達(dá)穩(wěn)定，可顯著提高生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的效率，降低成本。

2000年，McCreath等[7]應(yīng)用體細(xì)胞克隆生產(chǎn)出世界首例轉(zhuǎn)基因克隆豬，隨后2001年又得到雙基因敲除的的克隆綿羊。近年來發(fā)展起來的用于基因打靶的核酸酶包括鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）和聚類的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)大大豐富了制備用于核移植的體細(xì)胞的手段[8-10]。

圖2轉(zhuǎn)基因豬制備示意圖

4 胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法

此法是在體外將外源基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞，然后利用顯微操作儀將其注入動物囊胚中，參與宿主胚胎發(fā)育，最后得到轉(zhuǎn)基因動物。胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells,ES）是將早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出來，進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，建立的穩(wěn)定多能細(xì)胞系。這些胚胎干細(xì)胞通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔或病毒感染等方法將外源基因?qū)?，使ES細(xì)胞整合外源基因。利用這些細(xì)胞作為核移植的供體細(xì)胞，最后通過體細(xì)胞克隆技術(shù)制備出轉(zhuǎn)基因動物。對已經(jīng)分化的體細(xì)胞進(jìn)行重編程，以形成類似胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells），大大簡化了制備轉(zhuǎn)基因動物的過程。有學(xué)者分別利用iPS細(xì)胞，通過四倍體囊胚注射得到了存活并具有繁殖能力的小鼠，證明了iPS細(xì)胞的全能性[11]。

胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法優(yōu)勢在于胚胎干細(xì)胞在植入胚胎之前可體外選擇特殊的基因型，在細(xì)胞水平連續(xù)傳代、轉(zhuǎn)染，有利于陽性細(xì)胞的篩選。但是到目前為止只有小鼠和人的穩(wěn)定胚胎干細(xì)胞系，在其他大動物上，如豬、牛、馬等物種，還很難獲得穩(wěn)定的胚胎干細(xì)胞系，因此制約了該方法在實(shí)踐中的應(yīng)用。

5 精子介導(dǎo)法

精子介導(dǎo)法（sperm mediated gene transfer）是利用精子頭部能夠捕獲外源基因的特性，把精子與外源基因共孵育，使外源DNA被精子捕獲，然后再形成受精卵，最后制備出轉(zhuǎn)基因動物。1989年Lavitrano等[12]首次報(bào)道把PSV2CAT質(zhì)粒與小鼠的附睪精子共孵育，得到了陽性克隆小鼠，證明了使用精子作為外源基因的載體制備轉(zhuǎn)基因動物是可行的，這一研究成果得到了廣泛的關(guān)注。Perry等[13]將外源基因和精子頭部混合注入卵母細(xì)胞中，獲得的受精卵體外培養(yǎng)，進(jìn)行胚胎移植，成功獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。雖然這種方法提高了轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)效率，但是該方法對卵細(xì)胞的傷害較大，還未被應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。目前，很多實(shí)驗(yàn)室利用精子載體法獲得了很多不同種類的轉(zhuǎn)基因動物，如轉(zhuǎn)基因猴、馬、豬等。與其他轉(zhuǎn)基因方法相比，該方法操作簡單，使用成本低廉，不需要繁瑣的方法步驟和精密的儀器，進(jìn)而引起了眾多科研工作者的重視。該方法缺點(diǎn)是在大動物上獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體的陽性率較低，不穩(wěn)定。

綜上所述，轉(zhuǎn)基因技術(shù)經(jīng)歷幾十年的發(fā)展，日漸成熟，從隨機(jī)插入到定點(diǎn)整合，從單一技術(shù)到多元手段，科技人員一方面希望通過基因編輯改良動物的遺傳性狀，充分發(fā)揮動物的繁殖率、抗病率，以及改善肉類品質(zhì)等；另一方面也在研究把動物作為生物反應(yīng)器去獲取人類所需的藥品、優(yōu)質(zhì)蛋白和動物模型等，并取得了可喜的研究成果。但是在轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究中還有很多問題，包括生產(chǎn)技術(shù)上的難題和生物安全、人類健康、道德倫理等，這些都是現(xiàn)代和未來的科研工作者亟待解決的難題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用正在蓬勃發(fā)展，目前已經(jīng)涉及多個(gè)領(lǐng)域，未來更有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會意義。