乳酸菌性質(zhì)與抑制變異鏈球菌生物膜能力的相關(guān)性分析

姚沛琳，徐禮生，蘇博，高貴珍

(宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州，234000)

齲病是發(fā)病率高、流行范圍廣的口腔疾病。微生物是齲病發(fā)生的最主要因素，其中變異鏈球菌是公認(rèn)的致齲菌，原理是在牙面定植并形成牙菌斑生物膜[1]。牙菌斑生物膜是細(xì)菌在口腔中生存、代謝、致病的微生態(tài)環(huán)境，以生物膜狀態(tài)存在的細(xì)菌的生理特性與浮游狀態(tài)有顯著的不同，主要表現(xiàn)在抗藥性和各種生化代謝效率均顯著高于浮游狀態(tài)下的細(xì)菌[2-3]。

目前控制齲病的方法主要有機(jī)械法[4]和藥物法[5]，但它們都有明顯的不足之處。以益生菌為主的細(xì)菌替代療法越來越受到關(guān)注。主要集中于探討益生菌與口腔微生物相互作用的生物化學(xué)性質(zhì)，如生長抑制、細(xì)菌素的產(chǎn)生、共聚能力、生物膜的形成、胞外多糖的產(chǎn)生、對牙齒硬組織的黏附等[6]。篩選能夠預(yù)防齲病的益生菌也是基于上述理論基礎(chǔ)。NASE等[7]給1～6歲的兒童持續(xù)7個月服用含有益生菌的牛乳，發(fā)現(xiàn)能顯著降低口腔中變形鏈球菌和酵母菌的數(shù)量，蛀牙的發(fā)生率也明顯下降。AHOLA等[8]在研究短期食用含有LactobacillusrhamnosusGG和L.rhamnosusLC 705益生菌奶酪時，也發(fā)現(xiàn)益生菌可以減少口腔中齲齒病原菌的數(shù)量。TANZER等[9]研究發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌DSMZ16671與12株致齲性變異鏈球菌均有共聚能力，但與口腔中其他非致齲性的鏈球菌共聚能力較低，并對滅活后的副干酪乳桿菌DSMZ16671進(jìn)行了動物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組動物齲齒的發(fā)生率與對照組相比降低了23%。同時發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌DSMZ16671對唾液包被的羥基磷灰石的黏附能力極低，間接表明應(yīng)用在口腔中的乳酸菌應(yīng)該具有低黏附性能。KANG等[10]發(fā)現(xiàn)，來源于兒童唾液的2株食寇魏斯氏菌CMS1和CMS3能夠顯著抑制變異鏈球菌生物膜的形成，并且它們合成的水溶性葡聚糖也能夠抑制變異鏈球菌生物膜的形成。TAHMOURESPOUR等[11]發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌產(chǎn)生的表面活性劑能夠抑制變異鏈球菌生物膜的形成，主要是由于該表面活性劑能夠抑制生物膜狀態(tài)下變異鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶gifB/C的基因表達(dá)，從而減少水溶性和水不溶性葡聚糖的合成。

變異鏈球菌在口腔中形成生物膜是導(dǎo)致齲齒的第一步，因此在篩選對齲病有預(yù)防作用的乳酸菌方面，越來越多的研究者利用生物膜模型進(jìn)行篩選，但是在篩選標(biāo)準(zhǔn)方面，更多的是根據(jù)乳酸菌的某一種性質(zhì)，并沒做全面考慮，因此有必要確定比較全面的篩選標(biāo)準(zhǔn)來指導(dǎo)篩選工作。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

變異鏈球菌(Streptococcusmutans)ATCC25175，中國微生物所菌種保藏中心。

乳酸菌來源：從唾液、泡菜、健康成人糞便、內(nèi)蒙古奶酪、莧菜梗鹵汁等處分離。

1.2 設(shè)備及試劑

SX-300高壓滅菌鍋，TOMY公司； GRP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；5415R和5804R冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；MΜLTISKAN GO酶標(biāo)儀，Thermo公司；LSM 710激光共聚焦顯微鏡，德國蔡司公司；DG250厭氧培養(yǎng)箱，華粵行儀器有限公司。

MRS培養(yǎng)基，TSB培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

主要試劑：溶菌酶、PI染料,Sigma公司；CFSE熒光染料,Invitrogen公司；醋酸氯己定溶液(商品名：洗必泰),北京麥迪海藥業(yè)有限責(zé)任公司。

1.3 乳酸菌對變異鏈球菌的抑菌性實(shí)驗(yàn)

采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法[12]。將活化3代的乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)20 h，在4 ℃和12 000 r/min下離心20 min，取上清液，調(diào)pH值至4.0，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜后，收集濾液得到乳酸菌無細(xì)胞發(fā)酵上清液。取0.1 mL的1×108CFU/mL的S.mutans菌懸液與TSB固體培養(yǎng)基混合均勻，倒入內(nèi)徑一致且水平放置的培養(yǎng)皿中，凝固后用鑷子將無菌的牛津杯(內(nèi)徑為6 mm)輕輕、均勻地放置在培養(yǎng)皿中。取0.2 mL乳酸菌無細(xì)胞發(fā)酵上清液加入到牛津杯中，將此平板正面靜置于37 ℃培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈大小。選取MRS液體培養(yǎng)基(pH值調(diào)整為4.0)作為陰性對照，醋酸氯己定溶液作為陽性對照。

1.4 乳酸菌對變異鏈球菌生物膜形成的影響

乳酸菌與S.mutans均過夜培養(yǎng)12 h，分別接種于37 ℃預(yù)熱的新鮮MRS和TSB培養(yǎng)基中，37 ℃，厭氧培養(yǎng)18 h，然后調(diào)節(jié)菌濃度約為1×105CFU/mL。在直徑6 cm的玻璃培養(yǎng)皿中放入18 mm×18 mm規(guī)格的無菌蓋玻片，在0 h時加入S.mutans菌懸液1 mL、乳酸菌菌懸液0.2 mL和含有質(zhì)量濃度為2.5 g/L蔗糖的TSB培養(yǎng)基3 mL ，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。取出玻璃片，PBS沖洗2次，去除表面浮游細(xì)菌，立即于室溫下暗箱中染色[13]。用熒光染料CFSE和PI分別對活菌和死菌進(jìn)行染色。在37℃下孵育30 min，避光，最后用PBS洗滌，除去殘留染料。將上述已完成熒光染料的變異鏈球菌生物膜標(biāo)本放置在CLSM下觀察[14]。生物膜中細(xì)菌量的變化和生物膜活性分別用細(xì)菌總面積減少率和活菌百分比表示：即細(xì)菌總面積減少率/%=(實(shí)驗(yàn)組-對照組)/對照組×100，生物膜活性/%=生物膜中活菌面積/生物膜中細(xì)菌總面積×100。陰性對照組和陽性對照組分別加入等量的生理鹽水和醋酸氯己定溶液。每組3個以上平行樣品，重復(fù)2次實(shí)驗(yàn)。

1.5 乳酸菌菌體性質(zhì)與抑制效果關(guān)系的分析

1.5.1 乳酸菌的自聚集能力與抑制效果關(guān)系的研究

乳酸菌活化培養(yǎng)后，取一定量的菌液，3 000 r/min離心15 min，棄上清，收集菌體，用pH值為7.0的PBS洗滌2次，重懸浮于PBS中，調(diào)OD600=0.6±0.05，菌濃度約為107～108CFU/mL，37 ℃靜置培養(yǎng)，測定不同時間下上層液體的OD600吸光值[15]。其中A0代表0 h的吸光值；At代表th的吸光值。

1.5.2 乳酸菌自身生物膜形成能力與抑制效果關(guān)系的研究

參照KHAN等[13]的方法，具體如下：乳酸菌過夜培養(yǎng)，接種于37 ℃預(yù)熱的含有質(zhì)量濃度為2.5 g/L蔗糖的改良TSB培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)18 h，調(diào)節(jié)菌濃度為1×105CFU/mL，然后取0.2 mL菌懸液加入到96孔板中。37 ℃培養(yǎng)24 h，棄游離細(xì)菌，每孔用0.2 mL的去離子水輕柔洗滌3次；自然干燥后每孔加入0.05 mL 10 g/L的結(jié)晶紫溶液，室溫下染色15 min，使結(jié)合的細(xì)菌著色；傾去染色液后，用去離子水洗滌3次以上；干燥后每孔加入0.2 mL乙醇/丙酮混合液顯色，酶標(biāo)儀600 nm測定吸光度。以相同條件下S.mutans生物膜形成能力為對照組，各實(shí)驗(yàn)組每次做3個以上平行，重復(fù)3次。

1.5.3 乳酸菌和浮游的變異鏈球菌的共聚能力與抑制效果關(guān)系的研究

乳酸菌和S.mutans均過夜培養(yǎng)12 h，然后各取一定量的菌液，3 000 r/min離心15min，棄上清，收集菌體，用pH值為7.0的PBS洗滌2次，重懸浮于PBS中，乳酸菌調(diào)節(jié)為OD600=0.6±0.05，S.mutans調(diào)節(jié)為OD600=0.5±0.05，此時這2株菌的濃度均約為107～108CFU/mL。等量的乳酸菌和S.mutans混合，充分振蕩2 min，37 ℃靜置培養(yǎng)，測定不同時間下上層液體的OD600吸光值。其中Ax為0 h乳酸菌的吸光值，Ay為0 h變異鏈球菌的吸光值，Amix為th后混合的吸光值[15]。

1.5.4 乳酸菌表面疏水性與抑制效果關(guān)系的研究

乳酸菌表面疏水性的測定參考SAMOT等[16]的方法并稍有改變。以二甲苯作為疏水性有機(jī)溶劑。乳酸菌菌體在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下，離心15 min，洗滌2次，重懸于0.1 mol/L KNO3(pH值為6.2)中，在600 nm下調(diào)吸光度為0.6，記為A0；將1 mL有機(jī)溶劑加入到3 mL菌液中，在室溫下先預(yù)培養(yǎng)10 min，之后振蕩2 min，再在室溫下培養(yǎng)20 min，吸取并測水相在600 nm下的吸光度，記為A1。

1.5.5 乳酸菌表面酸堿電荷與抑制效果關(guān)系的研究

選擇乙酸乙酯作為路易斯堿，氯仿作為路易斯酸，按照1.5.4的方法測定。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌的抑菌性與抑制變異鏈球菌生物膜間相關(guān)性分析

根據(jù)前期抑菌實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，隨機(jī)選擇抑菌效果有差異，來源不同的乳酸菌，通過比較各實(shí)驗(yàn)組生物膜中細(xì)菌總面積較對照組的減少率來判斷不同的乳酸菌抑制變異鏈球菌生物膜形成的效果。由圖1可見，乳酸菌的抑菌性與其對變異鏈球菌生物膜形成的抑制效果間并不呈正相關(guān)關(guān)系，相反如RS4、RS7、17A這些抑菌效果表現(xiàn)差的菌株，其對生物膜形成的抑制效果表現(xiàn)較好；如PC-M8、LGG、La-137這些抑菌效果表現(xiàn)好的菌株，其對生物膜形成的抑制效果表現(xiàn)較差。

圖1 乳酸菌抑菌性與其抑制生物膜形成效果間的相關(guān)性Fig.1 The relation between LAB antibacterial activity and inhibiting biofilm formation ability

在變異鏈球菌生物膜形成階段，乳酸菌與變異鏈球菌的相互作用比較復(fù)雜，乳酸菌可能會產(chǎn)生抑制，也可能與變異鏈球菌發(fā)生共聚，共聚體可能一起黏附在固體表面，此種情況會加速有害生物膜的形成；也可能不黏附在固體表面，而是排出體外，這種是最理想的情況，圖1顯示乳酸菌對變異鏈球菌生物膜的抑制能力并不會隨著對變異鏈球菌抑菌能力的增強(qiáng)而增強(qiáng)，進(jìn)一步揭示了變異鏈球菌生物膜形成的復(fù)雜性。

2.2 乳酸菌的菌體性質(zhì)與抑制變異鏈球菌生物膜間相關(guān)性分析

2.2.1 乳酸菌的自聚集能力與抑制效果關(guān)系的分析

為了方便分析乳酸菌的菌體性質(zhì)與抑制效果之間的關(guān)系，根據(jù)2.1所示，分別從好、中、差3個水平中隨機(jī)選取了10株(即RS4、FB-T9、LY-103、WT-143、YH-145、PC-T4、La-137、PC-M8、La、LGG)對S.mutans生物膜形成影響有差異的乳酸菌來研究。結(jié)果如圖2所示。

圖2 乳酸菌對變異鏈球菌生物膜形成的影響Fig.2 Effect of LAB on S. mutans biofilm formation

本實(shí)驗(yàn)測定了各乳酸菌在37 ℃下第2小時和第4小時的自聚集能力，從圖3可以看出，大部分乳酸菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的自聚能力，并且均隨著時間的增加而增加。結(jié)合抑制生物膜的效果(見圖2)，可以看出，除了RS4這株菌外，自聚集能力較強(qiáng)的其他菌株，如PC-M8，PC-T4，LGG，La3137等在抑制變異鏈球菌生物膜形成能力上，效果均較差。

圖3 乳酸菌的自聚能力Fig.3 Auto-aggregation ability of LAB

2.2.2 乳酸菌自身生物膜形成能力與抑制效果關(guān)系的分析

結(jié)合抑制生物膜的結(jié)果(見圖2)與乳酸菌自身生物膜形成能力(見圖4)的結(jié)果，可以看出，RS4、FB-T9、LY-103、WT-143和La自身生物膜形成能力較低，其抑制S.mutans生物膜形成效果也較好，同樣，YH-145、PC-T4、PC-M8、LGG和La-137自身生物膜形成能力較強(qiáng)，其抑制S.mutans生物膜形成效果也較差。說明乳酸菌自身生物膜形成能力與抑制S.mutans生物膜形成效果之間呈負(fù)相關(guān)，即自身生物膜形成能力越小，抑制S.mutans生物膜形成效果越好。

圖4 乳酸菌自身生物膜形成能力的評價Fig.4 The ability of LAB biofilm formation

2.2.3 乳酸菌和浮游的變異鏈球菌的共聚能力與抑制效果關(guān)系的分析

從圖5可以看出，實(shí)驗(yàn)中所用到的10株乳酸菌均與浮游的S.mutans有一定的交互凝集能力，并且隨著時間的增加而增加。在2 h時彼此之間的差距不是很大，但4 h時差距開始拉大。結(jié)合抑制生物膜的效果(見圖2)可以看出，除了RS4這株菌外，其他菌株基本上表現(xiàn)出共聚能力強(qiáng)，抑制效果差的特點(diǎn)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有可能是RS4在與浮游的S.mutans共聚時，掩蓋了S.mutans與固體介質(zhì)的黏附位點(diǎn)，其自身又不易黏附在固體介質(zhì)上，所以可以攜帶S.mutans一起排出口腔。

圖5 乳酸菌與變異鏈球菌的共聚集情況Fig.5 Co-aggregation of LAB and S. mutans

2.2.4 乳酸菌的表面性質(zhì)與抑制效果關(guān)系的分析

從圖6可以看出，這10株乳酸菌的疏水性差別較大，在5%～70%間浮動。然而結(jié)合抑制生物膜的效果(見圖2)發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的表面疏水性與抑制效果之間并不具有規(guī)律性。這個研究結(jié)果與SAMOT等[16]的并不相符合，他們研究發(fā)現(xiàn)13株能夠在羥基磷灰石片上形成生物膜的乳酸菌，其中有10株具有較低的表面疏水性(0～35%)，并把這一性質(zhì)作為篩選口腔益生菌的標(biāo)準(zhǔn)之一。而本研究的觀點(diǎn)是具有預(yù)防齲病潛力的乳酸菌應(yīng)該具有較低的生物膜形成能力，較高的疏水性，這樣可以確保乳酸菌不在牙齒表面大量聚集，同時可以保證一定數(shù)量的乳酸菌黏附在口腔粘膜上發(fā)揮作用。結(jié)合乳酸菌自身生物膜形成能力的結(jié)果(見圖4)，同樣可以發(fā)現(xiàn)RS4這株乳酸菌更符合該要求。

圖6 乳酸菌的表面疏水性分析Fig.6 The surface hydroxyapatite of LAB

從圖7可以看出，這10株乳酸菌的表面酸電荷差別較大，在16%～70%之間浮動。而表面堿電荷普遍較低，多數(shù)在10%以下，只有RS4較高，達(dá)到了67%。

圖7 乳酸菌的表面酸堿電荷Fig.7 The surface acid-base charge of LAB

結(jié)合抑制生物膜的效果(見圖2)，可以看出，像RS4、FB-T9、WT-143、La這些有著較低的酸電荷和較高的堿電荷的菌株，它們與變異鏈球菌相互作用時，能夠抑制變異鏈球菌生物膜的形成。與之相對的，PC-M8、PC-T4、LGG、La-137有著較高的酸電荷和較低的堿電荷，它們與變異鏈球菌相互作用時，能夠促進(jìn)更加緊密的生物膜結(jié)構(gòu)的形成。因此可以得出的相關(guān)性規(guī)律是較高的酸電荷和較低的堿電荷有助于抑制效果的發(fā)揮。

3 討論

之前多是單純研究乳酸菌對非生物膜狀態(tài)下的變異鏈球菌的抑制作用，評價指標(biāo)也較單一，即抑菌效果好的乳酸菌就被認(rèn)為有預(yù)防齲病的潛力[17]。但是齲齒的發(fā)生與致齲性牙菌斑生物膜有著密切的關(guān)系，抑菌效果好的乳酸菌是否也會對處在生物膜狀態(tài)下的變異鏈球菌有同樣的作用效果，目前還沒有相關(guān)的報道。本實(shí)驗(yàn)的研究表明乳酸菌的抑菌性與其抑制變異鏈球菌生物膜間沒有相關(guān)性，更沒有之前推測的正相關(guān)關(guān)系。

對于有預(yù)防齲病潛力的乳酸菌，一方面希望它具有較高的自聚集能力，這樣有助于其自身在復(fù)雜的口腔環(huán)境中快速的生存與繁殖；另一方面不希望其以生物膜形式黏附在牙齒表面，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生的乳酸可能會腐蝕牙釉質(zhì)，進(jìn)而對牙齒造成不利影響[18]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，除了RS4這株菌外，自聚能力與抑制生物膜效果之間呈負(fù)相關(guān)。從抑制生物膜的效果上來看，RS4和FB-T9這2株乳酸菌均具有潛在的預(yù)防齲病功效，但是RS4表現(xiàn)出較強(qiáng)的自聚集能力，而FB-T9的自聚集能力較弱，說明RS4與FB-T9相比，在口腔中更易生存并且具有快速繁殖的優(yōu)勢。

乳酸菌與浮游的變異鏈球菌發(fā)生交互凝集后，可能有兩種結(jié)果，一種結(jié)果是聚集體不黏附在牙齒上，隨著吞咽、清潔等動作排出口腔；另外一種結(jié)果是聚集體黏附在牙齒上，加速了菌斑生物膜的形成[19]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，除了RS4這株菌外，共聚能力與抑制生物膜效果之間呈負(fù)相關(guān)。

結(jié)合乳酸菌自身生物膜形成能力的結(jié)果(見圖2～4)可知，自身生物膜形成能力高的菌體，如果同時具有較高的自聚集能力和較高的共聚能力，則會表現(xiàn)出促進(jìn)變異鏈球菌生物膜形成的結(jié)果。反之，自身生物膜形成能力低的菌株，如果在與變異鏈球菌共聚時能掩蓋變異鏈球菌與固體介質(zhì)的黏附位點(diǎn)，此時較高的自聚集能力和較高的共聚能力就能夠協(xié)助乳酸菌抑制變異鏈球菌生物膜的形成。因此在篩選對變異鏈球菌生物膜形成具有抑制作用的乳酸菌時，其自身生物膜形成能力是首先考慮的因素之一。

具有預(yù)防齲病功效的乳酸菌，不僅要對牙齒表面有著較低的黏附率，還需在口腔中保持一定的數(shù)量，防止其被唾液沖刷吞咽，即要對口腔黏膜具有一定的黏附性[20-21]。菌體對黏膜系統(tǒng)的黏附有2種方式，一種是特異性黏附，另外一種是非特異性黏附[22-23]。特異性黏附是通過特異的黏附因子起作用的，而非特異性黏附主要是通過疏水、氫鍵和靜電等發(fā)揮作用的，其中疏水作用和靜電作用起著主要作用[24]。根據(jù)上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)RS4這株乳酸菌表面疏水性較高，表面電荷也較多，因此其由疏水相互作用和靜電相互作用的粘膜黏附能力比較強(qiáng)，可能會對口腔內(nèi)頰面、舌背等具有較好的黏附性。

綜上分析，所測定的這些菌體性質(zhì)中乳酸菌自身生物膜形成能力與抑制S.mutans生物膜形成的效果之間呈明顯的負(fù)相關(guān)，而自聚能力和共聚能力與抑制效果的關(guān)系受自身生物膜形成能力的影響。因此，乳酸菌自身生物膜形成能力可能在抑制變異鏈球菌生物膜形成過程中發(fā)揮著重要作用，乳酸菌較低的生物膜形成能力可以保證其自身較少參與或不參與變異鏈球菌生物膜的形成，不會表現(xiàn)出促進(jìn)作用。表面疏水性與抑制效果無規(guī)律性。表面較高的酸電荷和較低的堿電荷有助于抑制效果的發(fā)揮，這一性質(zhì)可能有助于乳酸菌與變異鏈球菌表面某種黏附位點(diǎn)的結(jié)合，從而抑制變異鏈球菌對固體表面的黏附。因此可以看出，在抑制變異鏈球菌生物膜形成的過程中，乳酸菌的菌體性質(zhì)間是綜合起作用。本文為篩選具有預(yù)防齲病潛力的乳酸菌提供了理論依據(jù)。