大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681在不同溫度下的脂肪酸代謝變化

馮慧軍，翟磊，于學(xué)健，程坤，劉洋，姚粟

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

大曲高溫放線(xiàn)菌是芽胞桿菌目(Bacillales),高溫放線(xiàn)菌科(Thermoactinomycetaceae),高溫放線(xiàn)菌屬(Thermoactinomyces)的典型種，由姚粟等人于2014年在芝麻香型白酒高溫大曲中首次發(fā)現(xiàn)[1]，是芝麻香型白酒高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)菌種，對(duì)高溫大曲發(fā)酵及芝麻香型白酒特殊風(fēng)味形成具有不可忽視的作用[2]。高溫大曲發(fā)酵最高品溫達(dá)60 ℃以上，大曲高溫放線(xiàn)菌的高溫耐受特征是其在高溫大曲發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)代謝的基礎(chǔ)，深入認(rèn)識(shí)大曲高溫放線(xiàn)菌的耐熱機(jī)制不僅有助于掌握其生存特點(diǎn)和規(guī)律，而且有助于解析其在芝麻香型白酒釀造過(guò)程中的功能作用，從而有效指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

脂肪酸是細(xì)胞膜的重要組成成分，是影響細(xì)胞膜熱穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素。研究表明，微生物通過(guò)增加磷脂酰烷基鏈的長(zhǎng)度，增加脂肪酸異構(gòu)化支鏈的比例或增加脂肪酸的飽和度都可提高細(xì)胞膜的相變溫度，以維持高溫條件下細(xì)胞膜的液晶態(tài)[3-5]。因此，脂肪酸的代謝是影響微生物適應(yīng)外界高溫環(huán)境的一個(gè)重要機(jī)制。

本文以大曲高溫放線(xiàn)菌模式菌株CICC 10681為研究對(duì)象，利用RNA-seq技術(shù)結(jié)合氣相色譜研究了大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681在不同溫度下參與脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況及脂肪酸含量變化，旨在從分子層面及表型層面解析脂肪酸代謝對(duì)大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681耐熱性能的影響，為大曲高溫放線(xiàn)菌在芝麻香型白酒釀造過(guò)程中的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681分離自高溫大曲，保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。R2A液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨1.5，酸水解酪蛋白3，酵母浸粉3，可溶性淀粉3，K2HPO41.8，MgSO40.6，丙酮酸鈉1.8，蛋白胨1.5，葡萄糖10，pH 7，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 主要試劑及設(shè)備

TRizol試劑：Invitrongen公司；PrimerScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和SYBRPremix Ex TaqII試劑盒：TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；NaOH、NaCl、甲酸和濃HCl(分析純)：北京化工廠；正己烷(色譜純)：西隴化工股份有限公司；甲基叔丁醚(色譜純)：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；低溫離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；HP6890氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司，配備分流/不分流進(jìn)樣口，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)及HP氣相層析化學(xué)工作站，層析柱為Ultra-2柱，長(zhǎng)25 m，內(nèi)徑0.2 mm，液膜厚度0.33 μm。

1.3 方法

1.3.1 菌體收集

從甘油管轉(zhuǎn)接大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681菌體于R2A液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，55 ℃條件下180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，制備成種子液。將種子液在OD620下的吸光值調(diào)至0.5，按2%接種量接種至新的R2A液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在pH 7.0條件下，分別于45、55和60 ℃下，180 r/min振蕩培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液(OD620為0.5)，12 000 r/min離心1 min收集菌體。不同溫度下收集的菌體分別記為S45、S55和S60，-20 ℃保存供后續(xù)分析使用。

1.3.2 RNA測(cè)序確定脂肪酸代謝基因差異表達(dá)

參照TRizol試劑使用說(shuō)明書(shū)提取總RNA，采用Agilent 2100 Bioanalyzer和Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)對(duì)總RNA的純度、濃度及完整性進(jìn)行質(zhì)控，需保證RNA的OD260/280在1.8～2.2之間，RNA完整性(RIN值)在8以上，質(zhì)控合格后利用BGISEQ-500測(cè)序儀測(cè)序。

對(duì)高通量測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行質(zhì)控，去除接頭污染序列、無(wú)意義序列(N的含量大于10%)及低質(zhì)量序列(Q值≤5的堿基數(shù)占序列總長(zhǎng)度的50%以上)，得到有效數(shù)據(jù)(clean reads)[6]。使用Biwtie2軟件將有效數(shù)據(jù)比對(duì)到大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681參考基因組序列中[7-8]?；虮磉_(dá)定量使用RSEM工具完成，定量結(jié)果以FPKM(Reads Per Kilobases per Million reads)表示[9]。根據(jù)基因表達(dá)量(FPKM值)，計(jì)算各基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。通過(guò)控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)對(duì)P-value值進(jìn)行校正，定義FDR≤0.001且差異倍數(shù)大于2倍為差異表達(dá)基因。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

參照PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，去除RNA樣品中DNA污染并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR)的模板。利用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System，參照SYBRPremix Ex TaqII試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)液體系，使用兩步法擴(kuò)增程序(預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán))進(jìn)行反應(yīng)。采用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)反應(yīng)引物，以16S rRNA作為內(nèi)參基因，目標(biāo)驗(yàn)證基因的引物如表1所示，使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)差異倍數(shù)[10]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681脂肪酸代謝相關(guān)基因及引物Table 1 The genes and primers of fatty acid metabolism in Thermoactinomyces daqus CICC 10681 used for RT-qPCR

1.3.4 脂肪酸組分測(cè)定

脂肪酸提取參考《放線(xiàn)菌系統(tǒng)學(xué)—原理、方法及實(shí)踐》中描述方法，大致分為皂化、甲基化、提取、堿洗4個(gè)步驟[11]。脂肪酸測(cè)定采用氣相色譜法結(jié)合美國(guó)MIDI公司Sherolock全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化分析結(jié)果，氣相色譜條件為：爐溫為二階程序升溫，起始溫度170 ℃，以5 ℃/min的上升速度升至260 ℃，隨后以40 ℃/min升至310 ℃，維持1.5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為H2，流速0.5 mL/min，分流進(jìn)樣模式，分流比100∶1，進(jìn)樣量2 μL；檢測(cè)器溫度300 ℃，H2流速30 mL/min，空氣流速216 mL/min，補(bǔ)充氣(N2)流速30 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度大曲高溫放線(xiàn)菌脂肪酸代謝相關(guān)基因差異表達(dá)情況

大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681與脂肪酸代謝相關(guān)基因組成及在不同溫度下的差異表達(dá)如表2所示。與45 ℃相比，大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681在55和60 ℃時(shí)生物素羧基載體蛋白編碼基因accB分別上調(diào)表達(dá)8.6和11.3倍，生物素羧化酶編碼基因accC分別上調(diào)表達(dá)4.6和5.3倍，丙二酰輔酶A: ACP轉(zhuǎn)移酶編碼基因fabD分別上調(diào)表達(dá)8.6和8.9倍，β-酮脂酰-ACP合成酶III編碼基因fabH分別上調(diào)表達(dá)6.5和7.1倍，β-酮脂酰-ACP合成酶II編碼基因fabF分別上調(diào)表達(dá)6.5和9.2倍，β-酮脂酰-ACP還原酶編碼基因fabG分別上調(diào)表達(dá)8.6和9.2倍，β-羥脂酰-ACP脫水酶編碼基因fabZ分別上調(diào)表達(dá)8.6和9.2倍，烯脂酰-ACP還原酶編碼基因fabV分別上調(diào)表達(dá)6.5和7.0倍。大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681中與脂肪酸合成相關(guān)的11個(gè)基因中，8個(gè)基因在不同溫度下發(fā)生了差異表達(dá)，與45 ℃相比，在55和60 ℃時(shí)平均上調(diào)表達(dá)7.3和8.4倍。說(shuō)明隨著溫度升高，大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681增強(qiáng)了脂肪酸合成途徑。

表2 不同溫度下大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)情況Table 2 The differentially expressed genes related fatty acid metabolism inThermoactinomyces daqus CICC 10681 at different temperatures

注：“/”表示未發(fā)生差異表達(dá)

與45 ℃相比，大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681在55和60 ℃時(shí)脂酰輔酶A合酶編碼基因fadD分別下調(diào)表達(dá)7.5和7.8倍，脂酰輔酶A脫氫酶編碼基因acdA分別下調(diào)表達(dá)8.0和8.0倍，烯脂酰輔酶A水合酶編碼基因echA分別下調(diào)表達(dá)7.5和7.6倍，脂酰輔酶A轉(zhuǎn)酰酶編碼基因fadA分別下調(diào)表達(dá)6.1和6.9倍。大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681中與脂肪酸分解相關(guān)的4個(gè)基因全部發(fā)生了差異表達(dá)，與45 ℃相比，在55和60 ℃時(shí)分別平均下調(diào)表達(dá)7.3和7.6倍。說(shuō)明隨著溫度升高，大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681減弱了脂肪酸分解途徑。

乙酰-CoA是直鏈脂肪酸從頭合成的原材料，其主要通過(guò)丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體代謝產(chǎn)生[12]。與45 ℃相比，大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681在55和60 ℃時(shí)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體編碼基因pdhA、pdhB、pdhC和pdhD分別平均上調(diào)表達(dá)2.7和3.1倍。與直鏈脂肪酸不同，在支鏈脂肪酸的合成時(shí)乙酰輔酶A被分別由亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸經(jīng)支鏈酮酸脫水酶復(fù)合體代謝產(chǎn)生的異戊酰CoA(Isovaleryl-CoA)、異丁酰CoA(Isobutyryl-CoA)和2-甲基丁酰CoA(2-methylbutyryl-CoA)代替[13]。與45 ℃相比，大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681在55和60 ℃時(shí)支鏈酮酸脫水酶復(fù)合體編碼基因ilvE、ilvB和ilvD分別平均下調(diào)表達(dá)5.3和6.0倍(表3)。

表3 不同溫度下大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸分解相關(guān)基因表達(dá)情況Table 3 The differentially expressed genes related valine，leucine and isoleucine synthesis inThermoactinomyces daqus CICC 10681 at different temperatures

注：“/”表示未發(fā)生差異表達(dá)。

綜上，隨著溫度升高，大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681中直鏈脂肪酸合成通路呈上調(diào)趨勢(shì)。同時(shí)，在大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681中未發(fā)現(xiàn)與不飽和脂肪酸合成相關(guān)的β-羥脂酰-ACP脫水酶FabA和β-酮脂酰-ACP縮合酶FabB。說(shuō)明在高溫條件下大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681增強(qiáng)了直鏈飽和脂肪酸的合成。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明(圖1)，與45 ℃相比，大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681在55、60 ℃時(shí)乙酰輔酶A羧化酶編碼基因accB分別上調(diào)表達(dá)8.4和10.3倍，丙二酰輔酶A: ACP轉(zhuǎn)移酶編碼基因fabD分別上調(diào)表達(dá)7.9和9.4倍，β-酮脂酰-ACP合成酶II編碼基因fabF分別上調(diào)表達(dá)6.5和8.3倍。脂酰輔酶A脫氫酶編碼基因acdA分別下調(diào)表達(dá)7.1和7.7倍，脂酰輔酶A轉(zhuǎn)酰酶編碼基因fadA分別下調(diào)表達(dá)7.9和7.5倍。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與RNA-seq分析結(jié)果基本保持一致。

圖1 不同溫度大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681脂肪酸代謝相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 RT-qPCR verification results for genes related fattyacid metabolism in Thermoactinomyces daqus CICC 10681 at different temperatures

2.3 溫度變化對(duì)大曲高溫放線(xiàn)菌脂肪酸組成及含量的影響

大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681在不同溫度下脂肪酸組成及含量測(cè)定結(jié)果表明(表4)，大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681的脂肪酸主要以直鏈飽和脂肪酸(C16∶0、C18∶0)和單甲基支鏈飽和脂肪酸(iso-C15∶0、anteiso-C15∶0、iso-C16∶0、iso-C17∶0、anteiso-C17∶0)為主，且相同碳鏈長(zhǎng)度脂肪酸(C15∶0和C17∶0)中，iso式脂肪酸含量高于anteiso式脂肪酸含量。隨著溫度升高，支鏈飽和脂肪酸含量均呈下降趨勢(shì)，直鏈飽和脂肪酸含量呈上升趨勢(shì)，與45 ℃相比，大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681在60 ℃培養(yǎng)時(shí)，C16∶0的含量由8.99%上升到14.45%，升高了1.6倍，C18∶0的含量由1.38 %上升到12.73 %，升高了近10倍。

表4 不同溫度大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681的脂肪酸組成Table 4 Fatty acid composition of Thermoactinomycesdaqus CICC 10681 at different temperatures

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 討論

液晶態(tài)是細(xì)胞膜發(fā)揮保護(hù)作用、選擇性吸收、信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換等功能的物化性質(zhì)基礎(chǔ)。所謂液晶態(tài)是指某些有機(jī)化合物在發(fā)生固相到液相轉(zhuǎn)變時(shí)的過(guò)渡狀態(tài)，既具有液態(tài)的流動(dòng)性、黏度、變形等特性，同時(shí)也具有固態(tài)晶體的有序性。能形成液晶態(tài)的有機(jī)化合物一般為長(zhǎng)棒狀或平板狀，具有一定的剛性，還有極強(qiáng)的偶極矩和容易極化的基團(tuán)[14-15]。而構(gòu)成生物膜的各種磷脂分子也都具有上述特點(diǎn)。因此，微生物通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂分子的相變溫度來(lái)維持不同溫度下細(xì)胞膜的液晶態(tài)是其適應(yīng)外界環(huán)境溫度變化的一個(gè)重要機(jī)制[17]。

通常磷脂分子的相變溫度與結(jié)合在該磷脂上的脂肪酸熔點(diǎn)相同[18]。不同種類(lèi)的脂肪酸具有不同的熔點(diǎn)，總體趨勢(shì)為碳?xì)滏溤蕉?，越不飽和，則熔點(diǎn)越低，相同碳鏈的支鏈脂肪中，iso式脂肪酸的熔點(diǎn)要明顯高于anteiso式脂肪酸[19]。大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681的脂肪酸主要以飽和脂肪酸為主，而無(wú)不飽和脂肪酸，這可能與大曲高溫放線(xiàn)菌不含有與不飽和脂肪酸合成相關(guān)的FabA和FabB 2個(gè)酶相關(guān)。而且相同碳鏈長(zhǎng)度脂肪酸(C15∶0和C17∶0)中，iso式脂肪酸含量高于anteiso式脂肪酸含量，說(shuō)明大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681的脂肪酸相對(duì)主要以高熔點(diǎn)脂肪酸為主，高熔點(diǎn)的脂肪酸使其細(xì)胞膜具有較高的相變溫度，這在一定程度上與大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681的嗜高溫特性是吻合的。

需要強(qiáng)調(diào)的是，相同碳原子的直鏈脂肪酸與iso式脂肪酸的熔點(diǎn)大致相同，但直鏈脂肪酸構(gòu)成的磷脂分子的相變溫度要明顯高于iso式脂肪酸構(gòu)成的磷脂分子的相變溫度。這種差異與不同脂肪酸在磷脂分子的結(jié)合位點(diǎn)不同相關(guān)。如在枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)中，n-C15脂肪酸主要結(jié)合在磷脂分子的1號(hào)位置，anteiso-C15脂肪酸主要結(jié)合在磷脂分子的2號(hào)位置，Iso-C15脂肪酸則主要結(jié)合在磷脂分子的1號(hào)和2號(hào)位置之間[20]?？梢钥闯?，溫度升高條件下大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681增強(qiáng)了直鏈飽和脂肪酸的含量，降低了支鏈飽和脂肪酸的含量。這2種脂肪酸含量的變化可能都是大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681在高溫條件下提高其細(xì)胞膜相變溫度以維持細(xì)胞膜流動(dòng)性的有效調(diào)控方式。

4 結(jié)論

本研究利用RNA-seq技術(shù)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在分子水平研究了不同溫度下大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681脂肪酸代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)，并通過(guò)氣相色譜結(jié)合Sherolock全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)在表型水平研究了不同溫度下大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681脂肪酸的組成及變化。結(jié)果表明，溫度升高條件下，大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681增強(qiáng)了直鏈飽和脂肪酸的合成，減弱了支鏈飽和脂肪酸的合成，脂肪酸種類(lèi)及含量變化呈現(xiàn)出提高細(xì)胞膜相變溫度的變化趨勢(shì)，這種變化趨勢(shì)保證了大曲高溫放線(xiàn)菌CICC 10681在高溫條件下細(xì)胞膜功能的正常發(fā)揮，是其適應(yīng)高溫環(huán)境的一個(gè)重要機(jī)制。