鴨坦布蘇病毒RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

鄒 敏，張 青，王 紅，劉 東，劉新文，范根成?，吳發(fā)興

（1.青島易邦生物工程有限公司動物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266114；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

2010年4月以來，我國浙江、江蘇、山東、福建、河北、北京等省份的蛋鴨發(fā)生一種以產(chǎn)蛋率急速下降甚至停產(chǎn)及不同程度死亡為特征的疫病，俗稱鴨卵巢出血癥，亦稱為“鴨黃病毒感染”，現(xiàn)命名為鴨坦布蘇病毒病（Duck Tembusu Virus Disease）［1-2］。各品種蛋鴨、種鴨、鵝等家禽均有發(fā)生，但主要見于開產(chǎn)蛋鴨。產(chǎn)蛋鴨發(fā)病后出現(xiàn)長時間（40～60 d）的產(chǎn)蛋率低下，恢復(fù)后所產(chǎn)種蛋的受精率和孵化率出現(xiàn)下降。發(fā)病鴨群采食量顯著下降，拉綠色稀便，精神沉郁，扎堆，羽毛逆立，眼球深陷，目光呆滯，體重減輕；少量病鴨出現(xiàn)站立不穩(wěn)、震顫、行走困難和姿勢異常；主要病變?yōu)槌鲅月殉惭住㈤g質(zhì)性肝炎和非化膿性腦炎。該病近期成為危害中國養(yǎng)鴨業(yè)的重要疫病之一。產(chǎn)蛋率高的鴨群患病后4～5 d從產(chǎn)蛋高峰或高產(chǎn)蛋率迅速下降至20%～30%，嚴(yán)重的于發(fā)病后7 d左右停產(chǎn)；剛開產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋率上升緩慢或減蛋，長時間低產(chǎn)蛋率或無產(chǎn)蛋高峰出現(xiàn)。不同地區(qū)、不同品種鴨群發(fā)病率高低不一，群發(fā)病率幾乎100%，病死率0%～12%［3-5］。

由于是新發(fā)傳染病，人們對該病原及由其感染導(dǎo)致的發(fā)病認(rèn)識很不充分。對病原的生物學(xué)性狀、實(shí)驗(yàn)室檢測、診斷、治療和疫苗等的研究尚處于起步階段，缺乏能夠快速診斷或檢測方法。2011年3月，從臨床表現(xiàn)產(chǎn)蛋驟降的病死蛋鴨的7份發(fā)病組織樣品（卵巢、肝臟等）中，成功分離到4株坦布蘇病毒地方流行毒株（另文發(fā)表），借鑒現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，在查閱已公開發(fā)表的黃病毒快速檢測方法以及分子流行病學(xué)研究文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，開展了本病的實(shí)驗(yàn)室快速RT-PCR檢測研究。

1 材料與方法

1.1 毒株 鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）JN 株、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）、減蛋綜合癥病毒（Chicken egg down syndrome virus，

EDSV）、鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus， DHV）、傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）、傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）、番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirusis，MDRV）以及禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（Avian reticuloendotheliosis virus，REV），由青島易邦生物工程有限公司動物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 臨床發(fā)病樣品及預(yù)處理 共14份，由青島易邦生物工程有限公司技術(shù)服務(wù)部提供。每份樣品主要包括發(fā)病鴨的肝臟、卵巢組織等。樣品的預(yù)處理方法是：取每份樣品約5.0 g并剪碎，再加入4倍體積的PBS（pH7.2），混勻后研磨至糊狀，在-20 ℃、室溫條件下反復(fù)凍融3次，再經(jīng)4℃、12000 r／min離心10 min，收集上清液分裝后-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 DNAzol、Trizol Reagent購自 Invitrogen公司；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒、DL 2000 DNA Marker均購自寶生物（大連）工程有限公司；DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì) 登錄GenBank，分別下載了51個具有代表性的黃病毒全基因組序列及5個禽源黃病毒株的全部或部分E基因序列，經(jīng)DNAstar7.0軟件比對分析后，利用Primer5.0軟件自主設(shè)計(jì)了1對檢測引物，DTMUV-TF：5＇-TTACCATGGACAGGGTCATCA-3＇，DTMUV-TR：5＇-TCCAATTGTGCTCCCACTTCT-3＇，擴(kuò)增片段大小為 549 bp，交由生工生物工程上海（股份）有限公司合成，稀釋成工作濃度（20 pmol／L）-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒核酸的提取 按照Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol或DNAzol說明書分別提取上述9種病毒及14份樣品中可能含有的TMUV總RNA或其他DNA病毒總DNA，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RT-PCR 方法的建立

1.6.1 RT-PCR 反應(yīng)體系及程序 總體系 25 μL，包括 Primescript 1 step enzyme mix 2 μL、2×1step buffer 12.5 μL、DTMUV-TF 和 DTMUV-TR 各 0.5 μL、DTMUV-JN 株總 RNA 2.5 μL，最后用 DEPC H2O補(bǔ)至25 μL，反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min、94 ℃ 5 min、35×（94 ℃ 40 s、4／54.5／55／55.5 ℃ 40 s、72 ℃50 s）、72℃ 10 min，最后4℃冷卻10 min，PCR 結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠 100 V 45 min電泳檢查并成像。

1.6.2 特異性試驗(yàn) 用確定的最佳條件分別對陽性對照及其他相關(guān)的8種病毒進(jìn)行RT-PCR檢測，對其特異性進(jìn)行評價。取PCR產(chǎn)物5 μL，在1%瓊脂糖凝膠上電泳?；厥?49 bp的目的條帶，用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的DNA膠回收試劑盒回收目的片段進(jìn)行測序，并與黃病毒代表成員的E基因相應(yīng)核酸片斷進(jìn)行在線Blast分析，以進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的特異性。

1.6.3 敏感性試驗(yàn) 將所提取的 DTMUV-JN株總RNA進(jìn)行定量，10倍梯度連續(xù)稀釋，按上述PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，測定模板最低檢出量，判定該RT-PCR方法的敏感度。

1.6.4 重復(fù)性平行檢測 將所提取的DTMUV-JN株總RNA平分為5份，分別交給5位實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員，按照1.6.1項(xiàng)下的條件進(jìn)行 RT-PCR，驗(yàn)證該方法的可重復(fù)性。

1.6.5 臨床樣品的檢測 對14份疑似鴨坦布蘇病毒感染的樣品按照建立并優(yōu)化的RT-PCR方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)條件的確定 按1.6.1項(xiàng)配制好反應(yīng)體系進(jìn)行梯度PCR，電泳檢測結(jié)果見圖1。篩選出DTMUV的最佳一步法RT-PCR檢測退火溫度是55 ℃，時長 40 s。

2.2 特異性試驗(yàn) 用確定的RT-PCR條件對陽性對照J(rèn)N分離株、8個參考毒株進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果僅有陽性對照有預(yù)期目的條帶出現(xiàn)，其他8個參考毒株沒有目的條帶（圖2），說明本方法的特異性極佳?；厥漳康臈l帶測序獲得549 bp的特異性核酸序列（圖3）。

2.3 敏感性試驗(yàn) 用設(shè)計(jì)的特異性引物對不同濃度的DTMUV-JN株RNA直接進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果可檢測出即使是將提取的核酸稀釋至10-6，仍能檢出目的條帶（圖4）。

2.4 臨床樣品的檢測 應(yīng)用建立的方法對14份臨床疑似發(fā)病樣品按照優(yōu)化的RT-PCR條件進(jìn)行檢測，有6份陽性（圖5），經(jīng)克隆測序表明均是陽性目的判斷擴(kuò)增，檢出率為42.86%。

圖1 DTMUV RT-PCR檢測條件的確定Fig 1 Determination of RT-PCR assay for DTMUV

圖2 特異性實(shí)驗(yàn)Fig 2 Specificity of RT-PCR assay

圖3 DTMUV-JN株E基因擴(kuò)增區(qū)域基因序列Fig 3 Gene sequence of E gene amplification region of DTMUV-JN strain

圖4 敏感性分析Fig 4 Sensitivity of RT-PCR assay

圖5 應(yīng)用性檢測Fig 5 Application detection

3 討 論

在前期調(diào)查研究以及曹貞貞等人研究基礎(chǔ)上，已基本明確該病毒可能屬于黃病毒科成員［6］。根據(jù)國際病毒分類委員會第五次病毒分類報告，黃病毒科黃病毒屬分為蜱傳病毒、蚊媒病毒和節(jié)肢動物媒介未知的病毒，其中，蚊媒病毒類又分為Aroa病毒群、登革熱病毒群、日本腦炎病毒群、科科貝拉病毒群、恩塔亞病毒群、斯龐德溫尼病毒群和黃熱病病毒群［7］。依據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果，黃病毒的基因組為單股正鏈RNA，全基因組長約10990 bp，分別編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（Capsid、PrM和Envelop）、8種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、2K、NS4B 和NS5），另外在其基因組5＇端和3＇端均有一段非翻譯區(qū)［8］。為此，我們在設(shè)計(jì)檢測引物時為便于今后開展分子流行病學(xué)研究，以E基因?yàn)闄z測靶基因，從NCBI上下載了51個黃病毒的全基因序列以及率先發(fā)表的白洋淀病毒（BYD virus）及相關(guān)水禽黃病毒的E基因進(jìn)行了多序列比較，設(shè)計(jì)了一對黃病毒通用檢測引物，以期獲得較好的檢測結(jié)果。結(jié)果證實(shí)，該方法是成功的，具有極佳的擴(kuò)增效果。

準(zhǔn)確、快速地診斷疫病是畜禽疫病防控工作的首要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法如病毒分離、免疫熒光法等不僅操作繁瑣，而且耗時費(fèi)力，而PCR或RT-PCR技術(shù)主要針對病原體的基因組，具有良好的敏感性和特異性，對樣品的要求不高，已廣泛應(yīng)用于多種病原體的檢測和流行病學(xué)調(diào)查［9-11］。本研究設(shè)計(jì)了具有通用性的針對黃病毒E基因核酸序列的特異性引物對，建立的DTMUV RT-PCR方法具有較好的特異性，即使將陽性對照模板稀釋至10-6仍能夠檢測到目的片段，具有極好的重復(fù)性；對臨床病料中的14份疑似病例進(jìn)行檢測，檢出陽性樣品6份，該種黃病毒感染陽性率達(dá)42.86%，表明試驗(yàn)建立的RT-PCR方法可用于該病的實(shí)驗(yàn)室檢測／診斷。