中草藥對(duì)細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的消除作用研究

朱利霞，王洪彬，史秋梅，高光平

（河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島066604）

隨著抗菌藥物的泛用、濫用［1］，細(xì)菌耐藥性逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注的問(wèn)題。有關(guān)研究證實(shí)了細(xì)菌耐藥性能夠通過(guò)耐藥質(zhì)粒介導(dǎo)，由一種微生物轉(zhuǎn)移到另一種微生物［2-3］；此外，耐藥質(zhì)粒攜帶的多種耐藥標(biāo)記，也可經(jīng)由菌株間的接合而相互傳遞［4］，從而引起細(xì)菌對(duì)新的抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性，最終導(dǎo)致菌株的多重耐藥性和多重耐藥菌株的出現(xiàn)［5］，這促使研究者加快研究耐藥性質(zhì)粒消除的步伐。大腸桿菌等耐藥菌株在臨床上有逐年增多的趨勢(shì)，且耐藥性變遷的速度極快，另外，該菌的生長(zhǎng)、繁殖速度快，耐藥質(zhì)粒復(fù)制時(shí)能夠隨著遺傳物質(zhì)復(fù)制，使交叉耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥譜變寬。因此，要使細(xì)菌性疾病防治收到良好的效果，消除其耐藥質(zhì)粒具有極重要的意義。

一些研究者希望通過(guò)消除耐藥質(zhì)粒的方式，來(lái)解決細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題。20世紀(jì)60年代科研工作者就發(fā)現(xiàn)吖啶橙、溴化乙錠、十二烷基磺酸鈉（SDS）等物質(zhì)具有消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的作用，然而這些物質(zhì)因具有較強(qiáng)的毒副作用的，故不適合廣泛投入臨床應(yīng)用［6］，因此研究者試圖尋找安全有效、毒副作用小的消除劑用于細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的消除，使細(xì)菌恢復(fù)對(duì)抗菌藥物的敏感性。

中草藥屬于天然植物藥，價(jià)格低廉、毒副作用小，應(yīng)用安全；此外，還具有消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的作用［7］，因此篩選出具有較強(qiáng)消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒作用的中草藥，是今后解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題重要途徑之一。本文從細(xì)菌耐藥現(xiàn)狀、細(xì)菌耐藥性與質(zhì)粒關(guān)系、中草藥對(duì)細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的消除效果、中草藥消除耐藥質(zhì)粒的機(jī)理、存在的問(wèn)題、中草藥對(duì)耐藥質(zhì)粒消除的展望等方面進(jìn)行綜述。

1 細(xì)菌的耐藥現(xiàn)狀

近年來(lái)，抗菌藥物的濫用，使動(dòng)物養(yǎng)殖中細(xì)菌性疾病的防控變得更加困難，尤其是細(xì)菌的耐藥性增加，多重耐藥菌株的出現(xiàn)，致使細(xì)菌感染性疾病的發(fā)病率一直處于較高的水平，給日常動(dòng)物養(yǎng)殖帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。

細(xì)菌的耐藥性隨著抗菌藥物的產(chǎn)生而快速傳播。青霉素應(yīng)用于臨床2～3年后，就出現(xiàn)了耐藥的葡萄球菌［8］；諾氟沙星在1984年上市不久，法國(guó)、美國(guó)、德國(guó)等多個(gè)國(guó)家相繼出現(xiàn)了耐喹諾酮類(lèi)藥物的大腸桿菌；萬(wàn)古霉素有“抗生素最后一道防線”的美稱(chēng)，但1988年發(fā)現(xiàn)了耐萬(wàn)古霉素的腸球菌等。最近幾年，多重耐藥的菌株屢見(jiàn)不鮮，如多重耐藥的肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌等，給動(dòng)物養(yǎng)殖和人類(lèi)的健康造成了極大的威脅。

朱力軍［9］通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了不同年代的大腸桿菌臨床分離菌株的藥物敏感性不同。其中50年代分離的菌株對(duì)15種抗菌藥物表現(xiàn)敏感，60年代的菌株對(duì)鏈霉素和四環(huán)素耐藥；70年代分離的菌株對(duì)氨芐西林等6種抗生素耐藥，80年代至90年代初分離的大腸桿菌菌株對(duì)11種抗生素耐藥，由此可見(jiàn)菌株的多重耐藥性呈上升的趨勢(shì)；不同年代菌株的耐藥譜不同，其中60年代以耐2種抗生素的菌株為主，70年代以耐4、5種抗生素的菌株為主，80年代大多數(shù)表現(xiàn)為耐5、6、7種抗生素的菌株，90年代僅耐7種抗生素以上的菌株多［10］。這些都說(shuō)明，細(xì)菌的耐藥性逐年增加，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重。

2 細(xì)菌耐藥性與質(zhì)粒關(guān)系

質(zhì)粒是小型共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有獨(dú)立復(fù)制的能力，也是細(xì)菌生存非必需的一種遺傳因子。細(xì)菌的抗性、代謝能力、致病性、共生現(xiàn)象、接合轉(zhuǎn)移等表型特征常由質(zhì)?？刂疲?1］。質(zhì)粒包括R因子、Ti因子、F因子、Col因子、巨大質(zhì)粒和降解性質(zhì)粒等，其中R因子又稱(chēng)R質(zhì)粒，R質(zhì)粒上攜帶著耐藥基因，賦予細(xì)菌對(duì)部分抗生素的耐藥性［12］，并且在自然條件下R質(zhì)粒的丟失率很低。R質(zhì)粒常以轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式在菌株之間轉(zhuǎn)移，從耐藥菌株轉(zhuǎn)移到敏感菌株；在細(xì)胞分裂時(shí)，耐藥質(zhì)粒也可進(jìn)行復(fù)制，進(jìn)而使子代細(xì)菌也帶有耐藥質(zhì)粒，從而使細(xì)菌的耐藥性得以繼續(xù)傳播。

相關(guān)的研究證實(shí)了細(xì)菌耐藥性與質(zhì)粒之間存在著重要的關(guān)系［2］。 李德喜等［13］測(cè)定了 31株大腸埃桿菌對(duì)6種喹諾酮類(lèi)藥物的敏感性，并檢測(cè)了細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥基因（PMQR），結(jié)果顯示PMQR的出現(xiàn)加速了菌株間喹諾酮類(lèi)耐藥基因的快速傳播；嚴(yán)悅等［14］研究結(jié)果表明，大熊貓腸道中的大腸埃希氏菌的耐藥性也與菌株本身攜帶的質(zhì)粒有關(guān)。這些研究均表明，不同細(xì)菌對(duì)不同抗生素的耐藥性均可能與耐藥質(zhì)粒有關(guān)，也就給我們一個(gè)重要的提示：如果可以找到合適的消除劑，用于菌株耐藥質(zhì)粒的消除，那么就能夠延緩細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)。

3 中草藥對(duì)細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的消除效果

3.1 單味中草藥 目前有關(guān)將單味中草藥用于細(xì)菌耐藥質(zhì)粒消除的研究較多，以清熱解毒、清熱燥濕類(lèi)中藥為主。中藥消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒具有特殊的表型特點(diǎn)。首先，同一菌株的質(zhì)粒對(duì)不同中藥消除劑敏感性不同。張傳津等［15］利用6味中藥提取液對(duì)大腸桿菌耐藥性的消除作用研究，結(jié)果表明，地錦草提取物明顯優(yōu)于其他中藥提取物的消除效果，證實(shí)了不同中藥對(duì)同一菌株耐藥性消除效果不同。其次，同種中藥對(duì)不同菌株耐藥質(zhì)粒的消除效果也不盡相同［16］。 楊奇等［6］利用黃連、黃芩、連翹等8味中藥水煎劑為質(zhì)粒消除劑對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)菌、金黃色葡萄球菌的耐藥質(zhì)粒消除進(jìn)行研究，結(jié)果表明，8味中草藥對(duì)3種菌株的耐藥質(zhì)粒有消除作用，如圖1。

中草藥對(duì)細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的消除率，在一定范圍內(nèi)隨中草藥消除作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。陳群等［17］以黃芩和黃連的提取物作為質(zhì)粒消除劑，以攜帶耐藥質(zhì)粒的多重耐藥性的大腸桿菌為試驗(yàn)菌株，進(jìn)行耐藥質(zhì)粒的體外消除試驗(yàn)。結(jié)果顯示，黃芩和黃連連續(xù)作用24 h，消除率為2.42%，而時(shí)間延至48 h時(shí)，消除達(dá)到22.57%，尤以48 h的消除率最高。汪晶等［18］通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了五倍子對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌的耐藥質(zhì)粒有消除作用，且消除效果與作用時(shí)間有關(guān)，如表1、2。

單味中草藥對(duì)大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的消除效果往往因體內(nèi)、體外消除條件的不同而不同。張文平等［19］利用千里光水浸液對(duì)大腸桿菌耐藥質(zhì)粒進(jìn)行體內(nèi)和體外消除試驗(yàn)研究。結(jié)果顯示，千里光在體外作用 24 h、48 h、72 h 消除率分別為 0.2%、2.2%、3.8%，而體內(nèi)分別作用 24 h、48 h、72 h 其消除率分別為 0%、3.1%、14.4%。 苗強(qiáng)等［20］研究白頭翁提取液對(duì)銅綠假單胞菌耐藥質(zhì)粒的消除作用。結(jié)果顯示：無(wú)論在體內(nèi)還是體外條件下白頭翁對(duì)銅綠假單胞菌耐藥質(zhì)粒均有消除作用，且體內(nèi)的消除效果優(yōu)于體外，與張文平等［19］報(bào)道的結(jié)果一致。

中草藥成分復(fù)雜，采用不同的提取方式提取的中草藥的有效成分往往不盡相同，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)耐藥質(zhì)粒的消除效果不同。鞠洪濤等［21］用艾葉乙醇提取物和水提物對(duì)大腸桿菌慶大霉素耐藥性質(zhì)粒進(jìn)行了消除試驗(yàn)，結(jié)果顯示艾葉乙醇提取物的消除率為69.4%，艾葉揮發(fā)油的消除率為16.67%。同樣，劉彥晶等［22］通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了黃芩水提物和醇提物具有不同消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的作用。其中水提物對(duì)NDM-1乙酸鈣不動(dòng)桿菌的耐藥質(zhì)粒消除率高達(dá)61.27%，而醇提物對(duì)其的質(zhì)粒消除率僅為49.78%，因此對(duì)于同種中藥采用不同的提取方式所發(fā)揮的消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的作用往往是有一定差異的。

3.2 復(fù)方中草藥 研究資料顯示，單味中藥通過(guò)合理的配伍使用，組成的復(fù)方可以大大提高其對(duì)病原菌耐藥質(zhì)粒的消除率［23］。復(fù)方中草藥因其作用機(jī)理相對(duì)單味中藥復(fù)雜，所以到目前為止有關(guān)復(fù)方中草藥消除耐藥質(zhì)粒的研究較少。金澤明等［24］利用5種復(fù)方中藥對(duì)豬場(chǎng)大腸桿菌臨床分離菌株的耐藥性進(jìn)行消除試驗(yàn)研究，結(jié)果顯示原本對(duì)某些抗生素耐藥的豬恢復(fù)了對(duì)這些抗生素的敏感性。肖瀟等［25］以金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌株進(jìn)行耐藥質(zhì)粒研究。結(jié)果顯示在體外條件下，復(fù)方蒲公英具有消除其耐藥質(zhì)粒的作用。同樣，項(xiàng)裕財(cái)［26］的研究結(jié)果也證實(shí)了大蒜和蘆薈混合液能有效消除大腸桿菌耐氯霉素R質(zhì)粒和痢疾桿菌耐氯霉素R質(zhì)粒，說(shuō)明了大蒜和蘆薈混合液有治療、預(yù)防腸道細(xì)菌耐藥性的作用?？得返龋?7］研究了三黃片（鹽酸黃連素、黃芩總苷、大黃）對(duì)大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的消除作用，結(jié)果顯示耐藥質(zhì)粒消除率為31%，發(fā)揮了抑制細(xì)菌耐藥的功效。

圖1 單味中藥對(duì)3種菌株的質(zhì)粒消除結(jié)果［6］Fig 1 Plasmid elimination results of three strains of single herb

表1 五倍子對(duì)大腸埃希菌質(zhì)粒消除結(jié)果［18］Tab 1 Effect of galla chinensis on Escherichia coli plasmid elimination

表2 質(zhì)粒消除前后菌株對(duì)常用抗菌藥物的MIC值（mgC抗菌-1）［18］Tab 2 MIC of common antimicrobial agents before and after elimination of plasmids （mg·mL-1）

4 中草藥消除耐藥質(zhì)粒的機(jī)理

到目前為止，中藥消除耐藥質(zhì)粒的作用機(jī)理尚不清楚，而選擇中藥作為消除劑主要依據(jù)其抑菌活性，且以清熱、解毒或者清熱燥濕類(lèi)藥物為主。國(guó)內(nèi)外研究表明，敗醬草、蒼術(shù)、黃連、金銀花、魚(yú)腥草、黃芩、黃柏等具有直接消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒和抑制細(xì)菌耐藥性的作用［28-30］。

中藥成分復(fù)雜，如生物堿、醌類(lèi)化合物、鞣質(zhì)等，能夠?qū)?xì)菌產(chǎn)生一定的影響。其中黃連有效成分中的小檗堿，可以選擇性的抑制細(xì)菌DNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而達(dá)到消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的目的［17］；五倍子中的鞣質(zhì)能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性，最終使細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒得以消除［31］；黃芩中的黃酮類(lèi)的化合物能夠選擇性的抑制細(xì)菌DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，最終破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性，來(lái)達(dá)到消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的目的［32］。

陳小英［33］認(rèn)為中藥可能通過(guò)影響細(xì)菌DNA的合成以及作用于細(xì)菌細(xì)胞膜使DNA復(fù)制受阻這兩個(gè)途徑達(dá)到消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的目的；Miskolci C等［34］經(jīng)進(jìn)一步的研究認(rèn)為，消除劑能夠通過(guò)與質(zhì)粒DNA鏈中富含鳥(niǎo)嘌呤嘧啶的結(jié)構(gòu)區(qū)域之間復(fù)雜作用實(shí)現(xiàn)消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的目的，而這個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)往往與質(zhì)粒的正常復(fù)制有關(guān)。Zsuzsanna S等［35］通過(guò)試驗(yàn)證明薄荷醇和薄荷油都具有細(xì)菌耐藥質(zhì)粒消除作用，進(jìn)一步推測(cè)了該物質(zhì)消除作用機(jī)制可能與SDS相似。Beg A Z等［36］認(rèn)為白牡丹醇提物所具有消除耐藥質(zhì)粒的能力與醇其主要成分白花丹素具有的潛在的殺菌效力和DNA的嵌入能力有關(guān)；此外，亞抑菌濃度下，白花丹素還具有抑制細(xì)菌耐藥質(zhì)粒復(fù)制的作用。研究顯示，千里光消除大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的作用機(jī)制主要是中藥激發(fā)、增強(qiáng)了機(jī)體抵抗力和防御機(jī)能，消除腸道中菌群的耐藥質(zhì)粒，其中主要是為了清除細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒，提高菌群對(duì)藥物的敏感性，減低菌群自身的耐藥性［37-38］。劉彥晶等［22］以NDM-1乙酸鈣不動(dòng)桿菌為試驗(yàn)菌株，采用黃芩的水提物醇提物為消除劑研究其對(duì)該菌耐藥質(zhì)粒的消除機(jī)制。結(jié)果顯示黃芩的水提物和醇提物對(duì)攜帶 NDM-1質(zhì)粒乙酸鈣不動(dòng)桿菌均具有質(zhì)粒消除作用，其可能的機(jī)制為黃芩有效成分中的黃芩素與DNA發(fā)生嵌入作用，阻止了拓?fù)洚悩?gòu)酶催化DNA斷鏈的再連接，進(jìn)而導(dǎo)致核酸合成受阻，最終達(dá)到消除耐藥質(zhì)粒的作用。彭元麗等［39］總結(jié)了中藥對(duì)質(zhì)粒DNA多種干預(yù)機(jī)理，如中藥可以改變質(zhì)粒在細(xì)胞膜上的結(jié)合位點(diǎn)，使質(zhì)粒不能精確復(fù)制；中藥使得與質(zhì)粒DNA分配有關(guān)的蛋白質(zhì)部分或完全失活，導(dǎo)致質(zhì)粒 DNA復(fù)制中間物大量積累，但不產(chǎn)生子代DNA；中藥可嵌入質(zhì)粒DNA雙鏈中，影響質(zhì)粒復(fù)制；中藥與質(zhì)粒DNA雙鏈結(jié)合；（5）中藥可影響質(zhì)粒所必需酶的合成及活性，進(jìn)而使質(zhì)粒的合成受到影響；（6）中藥可誘導(dǎo)產(chǎn)生質(zhì)粒DNA復(fù)制抑制劑，使得質(zhì)粒的合成受阻；（7）中藥可誘導(dǎo)質(zhì)粒DNA耐藥基因發(fā)生變異，使其失去耐藥性等，但這些機(jī)理目前尚未得到證實(shí)。

5 存在的問(wèn)題

在篩選中藥消除劑的研究中，最大的問(wèn)題就是中藥對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)理不清楚。近年來(lái)，有關(guān)利用中草藥作為消除劑消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的研究?jī)H僅是停留在消除效果的觀察和驗(yàn)證這個(gè)層面上，對(duì)作用機(jī)理的相關(guān)研究卻極少；此外，盡管提出了許多種可能的消除機(jī)理，但是這些作用機(jī)理并未得到進(jìn)一步的證實(shí)。

中草藥具有的消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的作用大多是通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的，但是體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相差甚大，在體內(nèi)條件下中藥是否也具有穩(wěn)定有效的消除效果還不太清楚。少數(shù)體內(nèi)質(zhì)粒消除試驗(yàn)，雖然取得了良好的質(zhì)粒消除效果，但可能會(huì)因試驗(yàn)過(guò)程中未使用無(wú)菌動(dòng)物或者SPF動(dòng)物而不具有較強(qiáng)的說(shuō)服力。有關(guān)細(xì)菌耐藥質(zhì)粒消除機(jī)理方面的研究，仍然是未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)科研工作者研究的熱點(diǎn)。

6 中草藥對(duì)耐藥質(zhì)粒消除的展望

細(xì)菌耐藥性的形成嚴(yán)重困擾著廣大的科研工作者，若消除細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒，便可恢復(fù)菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。文獻(xiàn)顯示，賈愛(ài)卿等［40］研究顯示質(zhì)粒消除劑不但改變了鼠傷寒沙門(mén)氏菌的耐藥性，且使得該菌株的毒力明顯降低，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的存活與擴(kuò)散能力明顯減弱；同樣，張曉紅等［41］報(bào)道顯示耐藥質(zhì)粒消失的同時(shí)，菌株的粘附能力和致病力均減弱了。因此質(zhì)粒消除劑的研究不但能治療耐藥菌株的感染、阻斷其耐藥性的傳播，且能夠減弱病原菌的致病力，對(duì)于疾病的防控極具重要的意義。

近些年國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)表明，無(wú)論是中草藥、西藥抗生素還是化學(xué)物質(zhì)、物理方法，對(duì)細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒都具有一定消除作用。但是研究發(fā)現(xiàn)一些化學(xué)藥物和物理方法在消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的同時(shí)，對(duì)宿主機(jī)體也會(huì)產(chǎn)生一定的危害，不適合應(yīng)用于臨床上。中草藥來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，且安全可靠，毒副作用小甚至無(wú)毒副作用等［42-43］，以其作為耐藥質(zhì)粒消除劑，相比那些化學(xué)物質(zhì)或物理方法要好的多。雖說(shuō)中草藥對(duì)耐藥質(zhì)粒消除的機(jī)理不清楚，但是這并不能否定中草藥作為消除劑所具有的優(yōu)點(diǎn)以及其具有的開(kāi)發(fā)潛力。要想從根本上提高中藥的消除率，需要深入研究中藥消除耐藥質(zhì)粒的機(jī)理及中藥的配伍使用，還可以通過(guò)中西結(jié)合以達(dá)到更好的消除效果。迄今為止，還沒(méi)有一種中草藥被定為某種細(xì)菌所專(zhuān)用的消除劑，因此需對(duì)中草藥進(jìn)一步的深入研究，希望能夠研究出不同細(xì)菌、不同耐藥基因的專(zhuān)用中藥消除劑。