超高效液相色譜-靜電軌道阱質(zhì)譜正負(fù)切換同時(shí)篩查定量谷物飼料中的51種農(nóng)藥殘留

吳劍平，張 婧，周悅榕，嚴(yán) 鳳，潘 娟

（上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海201103）

隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)養(yǎng)殖技術(shù)的不斷進(jìn)步發(fā)展，飼料的質(zhì)量安全越來(lái)越受廣大養(yǎng)殖戶(hù)的重視。2018年歐洲發(fā)生的雞蛋中發(fā)現(xiàn)氟蟲(chóng)腈農(nóng)藥殘留事件再次將飼料中的農(nóng)藥殘留問(wèn)題推到了風(fēng)口浪尖。我國(guó)目前已發(fā)布的針對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行監(jiān)管的主要法規(guī)公告，其中于2013年3月正式實(shí)施的《中國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2016），規(guī)定了322種農(nóng)藥在10大類(lèi)食品中的2293項(xiàng)農(nóng)藥最大殘留限量，成為我國(guó)農(nóng)藥殘留食品安全市場(chǎng)監(jiān)管的唯一強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。雖然其對(duì)于谷物、油料作物、蔬菜、水果等食品中的農(nóng)藥殘留監(jiān)管十分有力，而對(duì)作為畜牧業(yè)重要投入品的飼料中的農(nóng)藥殘留并沒(méi)有明確規(guī)定，既沒(méi)有提出受監(jiān)管的種類(lèi)，也沒(méi)有提出相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)水果、蔬菜和谷物中多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法研究較多［1-3］，而關(guān)于飼料中多種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法卻相對(duì)較少［4-5］。當(dāng)今檢測(cè)食品中多種農(nóng)藥殘留的方法手段日趨多樣化，主要有高效液相色譜法（HPLC），氣相色譜法（GC）和色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、生物傳感器法和酶聯(lián)免疫法這五大類(lèi)。氣相色譜結(jié)合FPD或ECD檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)多種農(nóng)藥殘留具有靈敏度高和特異性好的特點(diǎn)［6-7］，但是，對(duì)于一些熱不穩(wěn)定和高沸點(diǎn)化合物就難以檢測(cè)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可以較好的彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，同時(shí)也具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn)［8-9］，有報(bào)道采用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法檢測(cè)蔬菜水果中65種農(nóng)藥殘留［10］，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到 20 μg／kg。 靜電軌道阱質(zhì)譜（Orbitrap Mass）作為高分辨率質(zhì)譜，相比串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜具有更高的質(zhì)量精確度，同時(shí)也具有較高的靈敏度和較寬的線(xiàn)性范圍，在多殘留分析中可以兼顧較多質(zhì)量數(shù)接近的化合物的定性準(zhǔn)確性和濃度差別較大的化合物的定量精密性［11-13］。

1 材料與方法

1.1 儀器 Ultimate 3000雙三元超高效液相色譜、Excalibur控制軟件、Trace Founder數(shù)據(jù)處理軟件，Mass Frontier化合物結(jié)構(gòu)推斷軟件，四極桿串聯(lián)靜電軌道阱質(zhì)譜帶HESI電離噴霧源（Q Exactive）、高速冷凍離心機(jī)（Allegra X-22R，BECKMAN COULTER）；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；水浴控溫氮吹儀（N-EVAP，上海安譜公司）。

1.2 材料、藥品與試劑 2，3，5-混殺威（2，3，5-Trimethacarb），3，4，5-混殺威 （3，4，5-Trimethacarb），涕滅威（Aldicarb），涕滅威亞砜（Aldicarbsulfoxide），滅害威（Aminocarb），惡蟲(chóng)威（Bendiocarb），丁酮威（Butocarboxim），丁酮威亞砜（Butocarboxim sulfoxide），丁酮砜威（Butoxycarboxim），甲萘威（Carbaryl），克百威（Carbofuran），3-羥基克百威（Carbofuran-3-hydroxy），乙硫苯威（Ethiofencarb），仲丁威（Fenobucarb），呋霜靈（Furathiocarb），異丙威（Isoprocarb），滅梭威（Methiocarb），滅多威（Methomyl），速滅威（Metolcarb，MTMC），滅殺威（Xylylcarb，MPMC），殺線(xiàn)威（Oxamyl），抗蚜威（Pirimicarb），猛殺威（Promecarb），殘殺威（Propoxur），特草靈（Terbucarb），硫雙威（Thiodicarb），久效威（Thiofanox），滅除威（XMC），乙霉威（Diethofencarb），苯硫威（Fenothiocarb），涕滅威砜（Aldicarb Sulfone）， 2，4，5-三氯苯氧乙酸（2，4，5-Trichlorophenoxy-Acetic acid， 2，4，5-T），2，4-二氯苯氧乙酸（（2，4-Dichlorophenoxy-Acetic acid， 2，4-D），2-萘氧乙酸（2-Naphthyloxyacetic Acid），4-氯苯氧基乙酸（4-Chlorophenoxyacetic acid），三氟羧草醚（Acifluorfen），苯草醚（Aclonifen），溴苯腈（Bromoxynil），調(diào)果酸（Cloprop），二氯吡啶酸（Clopyralid），環(huán)丙酸酰胺（Cyclanilide），2，4-滴丙酸（2，4-Dichlorprop racemate），氯氟吡氧乙酸（Fluroxypyr），氟磺胺草醚（Fomesafen），赤霉酸（Gibberellic acid），碘苯腈（Ioxynil），2-甲基-4-氯苯氧乙酸（2-Methyl-4-Chlorophenoxy Acetic Acid，MCPA），2-甲基-4-氯苯氧丁酸（2-Methyl-4-Chlorophenoxy-g-Butyric Acid，MCPB），2-甲基-4-氯苯氧丙酸（Mecoprop），魚(yú)藤酮（Rotenone），綠草定（Triclopyr）（50 μg／mL，Bepure?，北京振翔科技有限公司）；乙腈、甲酸（色譜純，Merk，德國(guó)）；去離子水（自制，電阻率≥18 MΩ·cm）；高純氮、高純氬（純度均為99.999%，上海佳杰特種氣體公司）。

1.3 色譜條件 色譜柱：Syncronis C18 150 mm×2.1 mm 3 μm，柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL／min，進(jìn)樣量：10 μL，流動(dòng)相：A 為 0.1%甲酸，B 為 0.1%甲酸乙腈，采用梯度洗脫程序如表1，所得典型特征離子質(zhì)量色譜（XIC）圖如圖1所示。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Procedure of gradient elution

圖1 樣品添加定量限濃度典型XIC圖Fig 1 Typical XIC of sample with LOQ concentration

1.4 質(zhì)譜條件 使用Thermo Fisher公司的Q Exactive四極桿靜電軌道阱質(zhì)譜帶HESI電離噴霧源質(zhì)譜檢測(cè)器對(duì)1 μg／mL的51種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行建庫(kù)優(yōu)化，兼顧各目標(biāo)化合物優(yōu)化后的質(zhì)譜條件為：選擇正負(fù)離子切換模式，正電壓3200 V，負(fù)電壓2600 V，鞘氣（Sheath gas）壓力344 kPa，輔助氣（Aux gas）流速 5 L／min，吹掃氣（Sweep gas）流速 0.3 L／min，碰撞氣壓力 0.2 Pa，毛細(xì)管（Capillary tube） 溫度325℃，輔助氣加熱（Aux gas heater temperature）溫度350℃，離子透鏡射頻電壓（S-lens RF voltage）50.0 V；掃描模式為全掃描加目標(biāo)物二級(jí)離子碎片掃描模式，一級(jí)母離子掃描范圍為100～800 M／Z，母離子掃描分辨率為70000，靜電軌道阱離子捕獲器門(mén)限值（AGC Target）為3×106，最大注入捕獲器時(shí)間（Maximum inject time）為 100 ms，二級(jí)碎片離子掃描分辨率為17500，二級(jí)碎片離子捕獲器門(mén)限值（dd-MS2 AGC Target）為 1×105，最大注入捕獲器時(shí)間（dd-MS2 Maximum inject time）為 50 ms，同時(shí)最大響應(yīng)離子（Top N）選取5個(gè)，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間（Dynamic exclusion time）5 s，數(shù)據(jù)處理軟件提取離子質(zhì)量精度5 ppm，精確至小數(shù)點(diǎn)后5位（表2）。

1.5 前處理?xiàng)l件 準(zhǔn)確稱(chēng)取谷物飼料樣品4.00 g，加入 5.00 mL 0.1 mol／L 鹽酸溶液振蕩濕潤(rùn)2 min，再加入15 mL甲醇，振蕩2 min后室溫下超聲15 min，然后8000 r／min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上層清液0.5 mL，加入 0.1% 甲酸 0.5 mL 混勻后 14000 r／min離心3 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

表2 51種農(nóng)殘化合物母離子和子離子Tab 2 Parent ion and Daughter ion of 51 Pesticides

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 線(xiàn)性定量范圍的確定 將51種農(nóng)藥殘留先用甲醇配制成50 μg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再將空白谷物飼料按1.5項(xiàng)樣品前處理方法獲得空白樣品基質(zhì)溶液，用此溶液將標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別稀釋成1、2、5、10、20、50、100、500 ng／mL 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液，按1.3項(xiàng)與1.4項(xiàng)的儀器方法上機(jī)檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線(xiàn)性回歸，獲得各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1～500 ng／mL區(qū)間內(nèi) 37 種化合物的 R2＞0.99（R＞0.995），14 種化合物的 R2＞0.98（R＞0.99），線(xiàn)性良好。

2.2 檢測(cè)限與定量限的確定 選擇20個(gè)空白樣品，按優(yōu)化條件進(jìn)行處理后上機(jī)測(cè)定，取與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜中相同保留時(shí)間的噪音信號(hào)平均值，以信噪比S／N≥3 為檢出限（LOD），S／N≥10 為定量下限（LOQ），確定該方法對(duì)的檢出限與定量限，國(guó)外有相關(guān)規(guī)定對(duì)不在其肯定列表目錄中的農(nóng)殘化合物一律要求不得高于 10 μg／kg 的限量［14］，因此，本方法在結(jié)合信噪比和實(shí)際檢測(cè)需要的情況下選擇10 μg／kg作為方法檢測(cè)限，20 μg／kg 作為方法定量限，其檢測(cè)限處各化合物信噪比見(jiàn)表2，實(shí)際樣品檢測(cè)限處XIC圖譜見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，檢測(cè)限附近峰型良好，定性準(zhǔn)確。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察 為驗(yàn)證方法基質(zhì)效應(yīng)，選取不同種類(lèi)空白谷物飼料6批，按1.5項(xiàng)前處理方法進(jìn)行操作，將其空白溶液中分別加入1倍定量限的51種農(nóng)藥殘留，其回收率結(jié)果在50%～120%之間，RSD＜10%，證明該前處理方法處理后的樣品溶液還是有一定的基質(zhì)效應(yīng)影響，但是，考慮到農(nóng)藥殘留物質(zhì)種類(lèi)繁多，性質(zhì)差異較大，作為一個(gè)多殘留物質(zhì)同時(shí)篩查和定量的方法，很難在兼顧到每一種目標(biāo)物的同時(shí)完全消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，因此，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定量，這可以在很大程度上減少基質(zhì)效應(yīng)影響，將其控制在可接受的范圍內(nèi)。

2.4 方法準(zhǔn)確度與精密度實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證方法精密度與準(zhǔn)確度，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法使用6批不同谷物飼料，每批稱(chēng)取等量6份，6份一組分三組，分別加入1倍定量限、2倍定量限、5倍定量限的51種農(nóng)殘化合物，所得結(jié)果如表4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法檢測(cè)谷物飼料中51種農(nóng)殘化合物時(shí)回收率結(jié)果在50.61%～109.49%之間，RSD＜10%，證明該方法具有較高的準(zhǔn)確度與精密度。

2.5 方法選擇性的驗(yàn)證 選擇20個(gè)空白樣品，按優(yōu)化條件進(jìn)行處理后上機(jī)測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)有假陽(yáng)性結(jié)果，表明該方法的選擇性良好。

表3 51種農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Tab 3 Standard curve of 51 Pesticides

表4 51種農(nóng)殘化合物準(zhǔn)確度和精密度Tab 4 Accuracy and precision of 51 Pesticides in Grain feed

續(xù)表

3 討論與結(jié)論

3.1 前處理方法的研究 嘗試了多種前處理方法，包括固相萃取柱法、分散固相萃取法和直接萃取后稀釋進(jìn)樣法，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是固相萃取柱法還是分散固相萃取法都會(huì)產(chǎn)生對(duì)某些化合物的歧視效應(yīng)，因?yàn)槎鄽埩魴z測(cè)面對(duì)的目標(biāo)化合物的范圍廣泛，性質(zhì)差異也較大，最后還是選擇直接萃取后稀釋法作為本方法前處理方法。嘗試了0.1 mol／L鹽酸溶液 ∶甲醇＝1 ∶3，1 ∶1，3 ∶1以及 0.1 mol／L 鹽酸溶液 ∶乙腈＝1∶3，1∶1，3∶1的提取1倍定量限、2倍定量限、5倍定量限的51種農(nóng)殘化合物的效率，主要考察對(duì)象為回收率均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并將其中回收率結(jié)果在均值的±40%以外的數(shù)據(jù)定義為乖離數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)其個(gè)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。通過(guò)這三項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)使用0.1 mol／L鹽酸溶液 ∶甲醇＝1 ∶3和1∶1以及0.1 mol／L鹽酸溶液 ∶乙腈＝1∶3的回收率均值均達(dá)到了70%以上，結(jié)合對(duì)各化合物回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差比較可知，使用0.1 mol／L鹽酸溶液與甲醇組成的提取劑均具有更小的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，而統(tǒng)計(jì)乖離數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)也佐證了0.1 mol／L鹽酸溶液 ∶甲醇＝1∶3具有更小的歧視效應(yīng)，因此，選擇該條件作為前處理方法。

表5 谷物飼料中51種農(nóng)殘化合物提取效率研究Tab 5 Research on Extraction Efficiency of 30 Carbarmates in grain feed

3.2 定性與定量方法的研究 根據(jù)歐盟相關(guān)規(guī)定［15］，以識(shí)別分（identification points，IPs）為基礎(chǔ)進(jìn)行化合物的定性分析，對(duì)于不同法規(guī)要求的殘留物，確證所需的IPs也各不相同，A類(lèi)（違禁）需滿(mǎn)足4IPs，B類(lèi)（限用）滿(mǎn)足3IPs，農(nóng)藥殘留適用違禁物質(zhì)A類(lèi)，因此，需要4IPs來(lái)進(jìn)行確證；不同的技術(shù)所獲得的IPs也不同，靜電軌道阱質(zhì)譜作為高分辨質(zhì)譜獲得的一個(gè)母離子有2.0IPs，相對(duì)應(yīng)的一個(gè)子離子有2.5IPs，因此，選出一對(duì)合適的母離子與子離子就可以確證一個(gè)農(nóng)殘化合物。按照此原則和1.3～1.4項(xiàng)的儀器方法，對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥殘留藥物進(jìn)行了標(biāo)品的進(jìn)樣并建庫(kù)分析，獲得最合適的目標(biāo)物母離子精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間以及其二級(jí)碎片離子的全掃描圖譜，結(jié)合Mass Frontier所推斷的子離子找出豐度最高的子離子和母離子一起作為確證所需的定性離子。51種農(nóng)藥殘留的保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)和子離子精確質(zhì)量數(shù)相結(jié)合可作為定性依據(jù)，具體信息見(jiàn)表2。定量時(shí)用一級(jí)母離子的精確質(zhì)量數(shù)對(duì)總離子流圖進(jìn)行提取色譜圖，對(duì)目標(biāo)物的色譜峰進(jìn)行積分，通過(guò)曲線(xiàn)校準(zhǔn)或單點(diǎn)校準(zhǔn)進(jìn)行定量分析。

3.3 區(qū)分同分異構(gòu)體的研究 方法中涉及的目標(biāo)化合物包含多對(duì)同分異構(gòu)體，比如丁酮威亞砜和涕滅威亞砜，丁酮威砜和涕滅威砜，丁酮威和涕滅威，滅除威和滅殺威等，它們具有相同的分子組成，因此，即使靜電軌道阱質(zhì)譜擁有高達(dá)140000分辨率的質(zhì)量精度也無(wú)法區(qū)分這些化合物，但是，多殘留篩查過(guò)程中不可排除這些化合物同時(shí)存在的可能，因此，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可采用三種不同方法解決這一問(wèn)題。其一，通過(guò)質(zhì)譜前端的液相部分對(duì)元素組成相同但分子結(jié)構(gòu)差異較大的化合物采用優(yōu)化梯度洗脫條件，增加色譜分離度的辦法，使同分異構(gòu)體目標(biāo)化合物的保留時(shí)間有較大差異，從而實(shí)現(xiàn)分離定性，例如本方法中丁酮威亞砜和涕滅威亞砜等；其二，通過(guò)質(zhì)譜源區(qū)對(duì)同分異構(gòu)體目標(biāo)化合物母離子帶電離行為的差異，分別檢測(cè)其不同的加合物形式進(jìn)行區(qū)分，例如丁酮威和涕滅威，丁酮威砜和涕滅威砜這兩對(duì)化合物經(jīng)過(guò)單標(biāo)進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)涕滅威和丁酮威砜在ESI+離子源作用下難以獲得+H的母離子，而主要以+Na離子形式存在，而丁酮威和涕滅威砜母離子則主要以+H形式存在，因此，在保留時(shí)間接近難以區(qū)分時(shí)，檢測(cè)不同形式的母離子加合物也可以起到區(qū)分同分異構(gòu)體的目的；其三，有些同分異構(gòu)體化合物保留時(shí)間非常接近，母離子加合物形式也相同，那只能通過(guò)單標(biāo)進(jìn)樣后分析其所產(chǎn)生的特征碎片離子的差異進(jìn)行區(qū)分，滅除威和滅殺威就是一例。

本研究建立了超高效液相色譜-靜電軌道阱質(zhì)譜法檢測(cè)谷物飼料中的51種農(nóng)藥殘留物的檢測(cè)方法和目標(biāo)化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。谷物飼料樣品經(jīng)0.1 mol／mL HCl∶甲醇＝1 ∶3 提取，高速離心，經(jīng)稀釋后進(jìn)樣分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，51種，農(nóng)殘化合物分離良好，在定量范圍內(nèi)均線(xiàn)性良好（線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r≥0.99），回收率也可達(dá)到 50.61% ～109.49% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于9.3%。本方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于谷物飼料中同時(shí)篩查和定量農(nóng)殘化合物。