高效液相色譜法測定阿昔洛韋片含量的儀器比對實驗

(1.遼寧省大連市藥品檢驗所，大連 116021；2.遼寧師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，大連 116029)

阿昔洛韋片是抑制DNA型抗病毒藥物, 臨床上主要用于乙型肝炎及水痘、帶狀皰疹、單純性皰疹病毒引起的皮膚和黏膜感染[1]。

高效液相色譜儀因其分離效能高，應(yīng)用范圍廣，分析速度快等優(yōu)勢，成為目前在化學(xué)分析領(lǐng)域應(yīng)用較多的儀器，以此建立的高效液相色譜分析方法在儀器分析領(lǐng)域的使用也很廣泛。高效液相色譜儀依據(jù)《JJG705-2014液相色譜儀檢定規(guī)程》每兩年進(jìn)行一次檢定，以評價儀器性能。但由于各臺儀器使用年限不同，檢測物質(zhì)不同，檢定時檢測指標(biāo)有限，即使每臺儀器在檢定時為合格，也可能導(dǎo)致實驗結(jié)果產(chǎn)生偏差。所以為了更準(zhǔn)確的評價各臺高效液相色譜儀，實驗室可以通過儀器比對試驗，使其避免受到這種偏差的影響。本次實驗選用6臺高效液相色譜儀，依據(jù)《中國藥典》2015年版二部[2]阿昔洛韋片的含量測定方法[3-5]，采用Z比分?jǐn)?shù)統(tǒng)計法對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，以評估不同高效液相色譜儀之間的差異，進(jìn)一步確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確和可靠。

穩(wěn)健統(tǒng)計[6-9]即利用一些受離群值影響較小的、穩(wěn)定的統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)來代替很容易受離群值影響的統(tǒng)計統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)，最大限度降低離群值影響的方法。例如平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差極易受到離群值影響，可以用不易受離群值影響的中位值和標(biāo)準(zhǔn)IQR代替。

1 儀器比對方法應(yīng)用[10，11]

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，紫外檢測器：2998；Acquity UPLC超高效液相色譜儀， PDA檢測器；Waters e2695高效液相色譜儀，紫外檢測器：2489；島津 LC-20AD高效液相色譜儀，紫外檢測器：SPD-20A；Dionex SUMMITP680A高效液相色譜儀，紫外檢測器：UVD170U；Waters e2695高效液相色譜儀，紫外檢測器：2489；電子天平(BP211D，BP221S，德國賽多利斯)；電熱恒溫振蕩水槽(DKZ-450B，上海森信實驗儀器有限公司)。

1.2 耗材與試藥

色譜柱：資生堂 PAK C18CAPCELL PAK 柱(250×4.6 mm,5μm)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm×2.1，1.7μm)；Thermo Hypersil GOLD C18柱(150×4.6 mm,5μm)；Kromasil C18柱(250×4.6 mm,5μm)；Agilent TC-C18柱(250×4.6 mm,5μm)；Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(250×4.6 mm,5μm)；甲醇(色譜純，MREDA)；鳥嘌呤對照品(批號140631-201606，中國食品藥品檢定研究院)；阿昔洛韋對照品(批號140630-201403，純度：99.8%，中國食品藥品檢定研究院)；阿昔洛韋片(規(guī)格：0.1g×24片，批號：B160406179)；氫氧化鈉(20160103，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 方法與結(jié)果

1.3.1 色譜條件

填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相：甲醇-水(10∶90)；檢測波長：254nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.3.2 溶液制備

供試品溶液：取阿昔洛韋片20片，精密稱定，平均片重：0.2008g，研細(xì)，密稱取細(xì)粉適量(稱取兩份①0.1000g，②0.0972g，每份約相當(dāng)于阿昔洛韋50mg)，將兩份藥品分別置于250mL量瓶中，加0. 4%氫氧化鈉溶液5mL，超聲1min，加水適量，于熱水浴(95～100℃)振搖10min，放冷至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5mL，置50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液(①0.01992mg/mL，②0.01936 mg/mL)。

對照品溶液：精密稱取阿昔洛韋對照品(已在105℃烘干4h干燥至恒重)適量(兩份①9.90mg，②10.22mg，)，置50mL量瓶中，用0.4%氫氧化鈉溶液5mL使溶解，用水稀釋至刻度，混勻，精密量取5mL，置50mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為對照品溶液(①0.01976mg/mL，②0.02040 mg/mL)。

1.3.3 含量測定

外標(biāo)法計算阿昔洛韋片的含量。進(jìn)樣次數(shù)：4次(供試品和對照品均為2次)兩份樣品所測含量平均值即為阿昔洛韋片的含量(結(jié)果保留到小數(shù)點后1位)。

2 結(jié)果統(tǒng)計

本方法以阿昔洛韋片的含量測定結(jié)果評價各高效液相色譜儀之間的差異，6臺儀器比對結(jié)果經(jīng)Grubbs檢驗[12,13]，都在95%置信水平，數(shù)據(jù)均有效，無異常值。中位值是將一組實驗數(shù)據(jù)按從小到大的順序排列，位于正中間位置的數(shù)值即為中位值。計算方法：先將這一組數(shù)據(jù)從小到大的順序排列，若是奇數(shù)個測量數(shù)據(jù)，則為排列在中間位置的數(shù)為中位值，若是偶數(shù)個測量數(shù)據(jù)，則排列在中間相鄰的兩個數(shù)據(jù)之和的1 /2為中位值。

極差是一組數(shù)據(jù)中的最大值減去最小值。穩(wěn)健變異系數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)四分位數(shù)間距比中位值：NIQR /中位值。結(jié)果見圖1及表1，從圖表的數(shù)據(jù)中可以清晰地觀察到，本次實驗統(tǒng)計結(jié)果數(shù)為6，極大值為99.6%，極小值為98.2% ; 變動范圍為1.4% ;中位值98.9%，標(biāo)準(zhǔn)化IQR為0.55。傳統(tǒng)統(tǒng)計中的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差由中位值和標(biāo)準(zhǔn)化IQR代替，由此避免了數(shù)據(jù)中存在的離群值的影響。而通過圖1可清楚地觀察到本次試驗中6組數(shù)據(jù)Z值均在│Z│≤2的范圍內(nèi)。

圖1 阿昔洛韋片含量比對試驗Z比分?jǐn)?shù)圖

代碼儀器編號儀器型號/檢測器型號結(jié)果(%)Z值1JY-050Waters2695/299898.2-1.722JY-060Waters UPLC/PDA98.7-0.493JY-070Waters2695/248998.7-0.494JY-037島津 LC-20AD/SPD-20A99.10.495JY-022DionexSUMMITP680A/UVD170U99.30.986JY-063Waters2695/248999.61.72平均值(%)98.9中位值(%)98.9四分位間距IQR0.55低四分位間距98.7高四分位間距99.25標(biāo)準(zhǔn)化IQR0.407715穩(wěn)健CV(%)0.4122497極大值99.6極小值98.2極差1.4

3 討論

儀器比對試驗作為實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制計劃的一部分對實驗室具有重要意義，通過比對試驗結(jié)果可以看出實驗室儀器的運行狀態(tài)，對于保證檢驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性意義重大。

Z比分?jǐn)?shù)為實驗室測得值減去中位值除以標(biāo)準(zhǔn)四分位數(shù)間距。Z值=(觀察值-中位值)/標(biāo)準(zhǔn)化四分位間距。Z比分?jǐn)?shù)判定規(guī)則：滿意結(jié)果：|Z|≤2；可疑結(jié)果：2<|Z|<3；離群結(jié)果：|Z|≥3。參加本次比對實驗的儀器中，6臺儀器均達(dá)到滿意結(jié)果。實驗室人員可以充分利用儀器比對結(jié)果，在參加能力驗證、限度邊緣樣品檢測、OOS樣品調(diào)查等試驗中，選擇Z值偏離較小的儀器進(jìn)行分析；對于比對中出現(xiàn)可疑結(jié)果的儀器，在日常使用中應(yīng)加以注意；對于儀器比對中出現(xiàn)不滿意結(jié)果的儀器，應(yīng)追根溯源，采取有效的措施去糾正錯誤。從試驗結(jié)果來看，本次參與比對的6臺液相色譜儀的Z值均小于2，說明儀器各自狀態(tài)穩(wěn)定，結(jié)果具有一致性[14,15]。

總之，儀器比對試驗對實驗室質(zhì)量控制具有重要作用。