全量程C-反應(yīng)蛋白定量檢測(cè)試劑盒的研制

譚有將，梁德智，陳 靜，戴盡波，陳 耀，余一海，石星亮

（1.廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院，廣東 佛山 528311；2.廣東順德墨賽生物科技有限公司，廣東 佛山 528311；3.廣東省佛山市順德北滘醫(yī)院，廣東 佛山 528311）

C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，簡(jiǎn)稱CRP）最早由Tillet和Frances于1930首先發(fā)現(xiàn)，是一種非常敏感的炎癥和組織損傷標(biāo)志物，因與肺炎雙球菌的莢膜C多糖起沉淀反應(yīng)而得名。CRP是機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下由肝臟合成的急性時(shí)相蛋白，在感染和非感染的許多疾病過(guò)程中，其濃度的改變可以提供有價(jià)值、及時(shí)的理論依據(jù)［1-6］。此外，C-反應(yīng)蛋白的輕度升高與冠狀動(dòng)脈事件、中風(fēng)及周圍血管病相關(guān)，是一項(xiàng)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素；C-反應(yīng)蛋白已被證實(shí)是由慢性炎癥引發(fā)心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，檢測(cè)其濃度對(duì)心血管疾病的干預(yù)及預(yù)后起重要作用而被臨床重視［7-12］。

目前市場(chǎng)上檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的試劑多以進(jìn)口的免疫比濁試劑為主［13］，檢測(cè)成本居高不下，隨著醫(yī)改的不斷深入，人民群眾普遍希望在不斷提升醫(yī)療服務(wù)質(zhì)量的同時(shí)，醫(yī)療價(jià)格能降到比較合理的水平。本研究的目的是開發(fā)一種基于熒光免疫層析技術(shù)的試劑盒，采用高熒光強(qiáng)度的熒光微球進(jìn)行標(biāo)記，所使用的主要原材料大部分為國(guó)產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)原料廠家提供，在確保達(dá)到臨床所需的檢測(cè)要求的同時(shí)，能夠大幅降低試劑的檢測(cè)成本。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1）主要原材料：CRP包被用單克隆抗體，北新化成生物科技有限公司；CRP標(biāo)記用單克隆抗體，北京萬(wàn)域美瀾生物科技有限公司；羊抗鼠IgG，洛陽(yáng)市佰泰科生物技術(shù)有限公司；時(shí)間分辨熒光微球，Bangs Lab公司；CRP國(guó)際參考物質(zhì)為ERM?-DA474/IFCC；CRP純化抗原，桂林英美特生物技術(shù)有限公司；NC膜，型號(hào)HF135，美國(guó)Milipore公司；其它化學(xué)試劑為分析純或者化學(xué)純。2） 三維平面點(diǎn)膜噴金儀，上海金標(biāo)生物科技有限公司；熒光免疫分析儀，為廣州藍(lán)勃生物科技有限公司提供。3）臨床樣本：佛山市順德區(qū)北滘醫(yī)院提供。4）臨床對(duì)照試劑：芬蘭QuikRead go 檢測(cè)系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 時(shí)間分辨熒光抗體結(jié)合墊制備

將時(shí)間分辨熒光微球取出置于離心管中，離心（18 000 rpm）60 min，棄上清，加入0.05 M MES（pH 6.0）清洗兩遍。加入EDC/NHS與室溫震蕩活化4 h后，離心（18 000 rpm）60 min。加入0.01 M PB（pH 7.0）將微球重懸，按1 mg微球標(biāo)記0.2 mg抗體的比例加入相應(yīng)抗體。室溫震蕩偶聯(lián)反應(yīng)2 h，加入0.5%的BSA室溫震蕩封閉2 h后，開始離心（10 000 rpm）60 min，棄上清，加入含0.5%BSA的0.01 M PBS，2～8 ℃保存?zhèn)溆?。將?biāo)記好的抗體稀釋成0.5 mg/mL，使用三維平面點(diǎn)膜噴金儀噴膜到結(jié)合墊（4 ul/cm）上，37 ℃干燥5 h，制成時(shí)間分辨熒光抗體結(jié)合墊，于濕度為RH30%～40%的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 包被抗體NC膜制備

用含0.5%乙醇胺的0.01 M PBS將CRP包被抗體配成0.5 mg/mL，然后使用三維平面點(diǎn)膜噴金儀將其按1.5 ul/cm進(jìn)行包被，同時(shí)包被1.5 mg/mL的羊抗鼠IgG，將NC膜于37 ℃干燥5 h，于濕度為RH30%～40%的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 試劑卡組裝

將準(zhǔn)備好的吸水紙、樣品墊、PVC底板、試劑卡殼等包裝材料在濕度為RH30%～40%的環(huán)境下進(jìn)行組裝，并切成小條（寬3.8 mm/條），將試劑條裝入試劑卡殼中，并壓殼制成檢測(cè)的試劑卡。放入鋁箔袋中，加入干燥劑，密封后與2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

將CRP純化抗原使用QuikRead go 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行定標(biāo)，并經(jīng)CRP國(guó)際校準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)后，配置成0.0、0.5、1.0、3.0、10.0、50.0、100.0、150.0 mg/L 的內(nèi)部校準(zhǔn)品，用制備好的試劑卡檢測(cè)，利用時(shí)間分辨熒光免疫分析儀進(jìn)行判讀，記錄檢測(cè)的信號(hào)。將濃度與檢測(cè)信號(hào)按最小二乘法進(jìn)行擬合曲線，再將擬合好的曲線參數(shù)錄入到時(shí)間分辨熒光免疫分析儀中，成為內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 樣本檢測(cè)

取10 uL全血或者5 uL血漿樣本，加入到2 mL的樣品稀釋液中，充分混勻后，取100 ul混合液滴入到試劑卡樣品孔中，室溫下反應(yīng)5 min后，用時(shí)間分辨熒光免疫分析儀判讀結(jié)果。

1.2.6 性能評(píng)估

分別使用CRP內(nèi)部校準(zhǔn)品、含干擾物的樣品等對(duì)試劑卡進(jìn)行檢測(cè)，按照《體外診斷試劑分析性能評(píng)估系列指導(dǎo)原則（征求意見稿）》及《CRP技術(shù)審查指導(dǎo)原則》評(píng)估檢測(cè)系統(tǒng)的分析靈敏度、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、特異性及其穩(wěn)定性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

檢測(cè)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)卡方檢驗(yàn)、Kappa一致性分析、線性回歸和Bland-Altman等分析考核試劑的相關(guān)性、一致性。同時(shí)檢測(cè)來(lái)自同一病人全血/血漿樣品各40份，考核試劑卡對(duì)不同標(biāo)本的檢測(cè)能力。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

用內(nèi)部校準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)濃度測(cè)試10次，剔除離群值后取平均值。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.0～150.0 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性范圍和相關(guān)性（r＞0.98）。

2.2 分析靈敏度

以0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.0 mg/L的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品各測(cè)定20次，以變異系數(shù)接近20%的最低濃度作為試劑盒的分析靈敏度，結(jié)果如表1。表明該試劑盒的分析靈敏度為0.1 mg/L。

表1 試劑盒的分析靈敏度檢測(cè)結(jié)果

2.3 精密度

選擇高（100.0 mg/L）、中（10.0 mg/L）、低（1.0 mg/L）三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行精密考察，共考察了3批產(chǎn)品，結(jié)果如表2。表明該試劑盒的批內(nèi)精密度＜15%，批間精密度＜20%，符合要求。

表2 試劑盒批內(nèi)及批間精密度檢測(cè)結(jié)果

2.4 特異性

選擇10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，分別在里面添加如表3中的物質(zhì)及其濃度，考察干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果如表3所示。表明干擾物質(zhì)對(duì)接觸結(jié)果影響甚微，偏差＜10%，符合要求。

表3 試劑盒干擾性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.5 與國(guó)外試劑盒比較

2.5.1 相關(guān)性分析

使用對(duì)比試劑盒及本試劑盒分別按照各自的方法檢測(cè)40份人的血液樣本，進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果如下，相關(guān)系數(shù)r2=0.989，與對(duì)比試劑具有良好的相關(guān)性。如圖1所示。

2.5.2 檢測(cè)樣本類型一致性分析

對(duì)來(lái)自同一份人全血和血漿標(biāo)本各40份樣本進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行回歸及相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r2=0.980，說(shuō)明檢測(cè)全血和血漿具有良好的一致性。

圖1 本試劑盒與對(duì)照試劑盒的相關(guān)性

3 討論

1）本試劑盒采用的主要原材料均為國(guó)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)原材料，大幅降低了企業(yè)的生產(chǎn)成本，同時(shí)也能為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。配合本公司的快速時(shí)間分辨熒光免疫分析儀使用，能為患者現(xiàn)場(chǎng)提供快速、準(zhǔn)確的結(jié)果，特別適合中小型醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)，方便普通民眾的檢測(cè)需求。

2）本試劑盒利用時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記抗體技術(shù)，結(jié)合固相層析技術(shù)，采用雙抗體夾心法原理，CRP單克隆抗體標(biāo)記時(shí)間分辨熒光物質(zhì)（熒光信號(hào)示蹤），通過(guò)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀俘獲檢測(cè)區(qū)域（T區(qū)）被激發(fā)的熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)區(qū)域/質(zhì)控區(qū)域的值與分析物的不同濃度獲得定標(biāo)曲線，實(shí)現(xiàn)人全血/血漿中的CRP定量檢測(cè)。

3）與一般的熒光物質(zhì)標(biāo)記不同，該方法采用了高熒光強(qiáng)度的時(shí)間分辨熒光微球進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)優(yōu)化標(biāo)記過(guò)程的每一個(gè)細(xì)節(jié)，使檢測(cè)試劑盒具有靈敏度高、檢測(cè)樣本用量少，檢測(cè)結(jié)果快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，保存有效期長(zhǎng)的特點(diǎn)。

4）本研究對(duì)試劑盒的精密度、靈敏度、線性范圍和偏倚進(jìn)行了分析和評(píng)估，并與進(jìn)口試劑進(jìn)行對(duì)比分析，兩者具有良好的相關(guān)性，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。能夠滿足臨床的檢驗(yàn)需求。

5）本研發(fā)過(guò)程采用了企業(yè)與醫(yī)療機(jī)構(gòu)聯(lián)合研發(fā)的模式，在確保研發(fā)質(zhì)量的同時(shí)，能提高了研發(fā)效率，縮短研發(fā)周期，節(jié)省時(shí)間成本。