HPLC同時測定復(fù)肝寧片中芍藥苷和綠原酸的含量

梁惠明，彭 敏，呂瓊芳，湯艷群，譚潔英*

（1. 江門市藥品檢驗所，廣東 江門 529030；2. 廣東省江門市新會區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，廣東 江門 529100）

復(fù)肝寧片是本地制藥企業(yè)生產(chǎn)的口服制劑，由板藍(lán)根、麥芽（炒）、柴胡、牡丹皮、山楂、金銀花、六神曲（炒）七味藥材組成。具有舒肝健脾，清熱利濕之功效，用于乙型肝炎表面抗原陽性屬于肝旺脾虛，熱毒較盛者[1]，臨床應(yīng)用廣泛。現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第四冊，該標(biāo)準(zhǔn)中未有含量測定部分。牡丹皮和金銀花均為復(fù)肝寧片的重要組分，牡丹皮為毛莨科植物牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）的干燥根皮，具有清熱涼血，活血化瘀之功效[2]，主要成分為芍藥苷等[3]。金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱之功效[4]，綠原酸是其主要活性成分之一[5]。為了提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文建立了高效液相色譜法（HPLC）同時測定牡丹皮中芍藥苷和金銀花中綠原酸的含量，該方法簡便、快速，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為復(fù)肝寧片質(zhì)量控制的有效方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀（LC-20AT 高壓泵，SPD-M20A 二極管陣列檢測器，SIL-20A 自動進(jìn)樣器，日本島津公司）； XS205DU電子分析天平（METTLER TOLEDO）；KQ-300DE型臺式數(shù)控超聲波清洗器（東莞科橋）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號110736-201438，含量96.4%，中國食品藥品檢定研究院）；綠原酸對照品（批號 110753-201314，含量96.6%，中國食品藥品檢定研究院）；復(fù)肝寧片（批號：170601、170602、170603，本地某制藥企業(yè)）；缺牡丹皮陰性樣品、缺金銀花陰性樣品均由本地制藥企業(yè)提供。乙腈為色譜純（HPLC級，Honeywell）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為SHISEIDO CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈- [（水- 磷酸-三乙胺（85:0.08:0.08 ）]（17:83）；流速1.0 ml/min；芍藥苷檢測波長230 nm，綠原酸檢測波長327 nm；柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算不低于5000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取芍藥苷對照品及綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 ml約含芍藥苷26 μg、綠原酸150 μg混合溶液，作為對照品溶液；另取芍藥苷對照品、綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇分別制成每1 ml約含芍藥苷26 μg、綠原酸150 μg溶液，作為專屬性試驗用芍藥苷對照品溶液及綠原酸對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取2片的量，精密稱定，置20 ml量瓶，加50%甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 分別取缺牡丹皮陰性樣品、缺金銀花陰性樣品按 2.2.2項下供試品溶液制備方法制備缺牡丹皮陰性樣品溶液和缺金銀花陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

分別精密吸取芍藥苷對照品溶液、綠原酸對照品溶液、供試品溶液、缺牡丹皮陰性樣品溶液、缺金銀花陰性樣品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1；供試品溶液色譜圖中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同保留時間的色譜峰，而缺牡丹皮陰性樣品溶液及缺金銀花陰性樣品溶液在此保留時間處無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取芍藥苷對照品適量，用50%甲醇制成含芍藥苷2.328 mg/ml對照品儲備液，分別精密量取儲備液0.5，1，2.5 ml置200 ml量瓶，再精密量取儲備液0.5，0.75，1 ml置20 ml量瓶，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成芍藥苷對照品系列溶液；另精密稱取綠原酸對照品適量，用50%甲醇制成含綠原酸5.878 mg/ml對照品儲備液，分別精密量取儲備液0.1，0.2，0.5，1，1.5，2 ml置20 ml量瓶，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成綠原酸對照品系列溶液。按2.1項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積A值為縱坐標(biāo)Y，分別以芍藥苷對照品和綠原酸對照品的濃度C（mg/ml）為橫坐標(biāo)X，計算回歸方程。結(jié)果表明：芍藥苷在0.00582～0.1164 mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=1×106X-11 973，r=0.9999；綠原酸在0.02939～0.5878 mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=3×106X-46 247，r=1.0000。

2.5 回收率試驗

取本品（批號為170601，平均片重0.2883 g，每片含芍藥苷0.2863 mg、含綠原酸1.4825 mg）約1片重，共9份，精密稱定，置20 ml量瓶，分別精密加入對照品混合溶液（含芍藥苷0.1271 mg/ml，含綠原酸0.7791 mg/ml）1，2，3 ml各3份，依2.2.2項方法制得供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，計算回收率（結(jié)果見表1、表2），結(jié)果芍藥苷平均回收率為98.55%，RSD=1.98% （n=9），綠原酸平均回收率96.92%，RSD=1.63%（n=9），結(jié)果表明，方法準(zhǔn)確度較好。

表1 芍藥苷回收率試驗結(jié)果

2.6 精密度

2.6.1 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，依2.2.2項方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，記錄峰面積。經(jīng)計算芍藥苷平均含量為0.2863 mg/片，RSD為 1.25%（n=6）；綠原酸平均含量為1.4825 mg/片，RSD為 1.84%（n=6）。結(jié)果表明，方法的重復(fù)性良好。

2.6.2 儀器精密度試驗 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。計算芍藥苷、綠原酸峰面積的RSD分別為 0.25%，0.47%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別在0，2，4，8，12，16，24 h測定峰面積，計算芍藥苷及綠原酸峰面積RSD分別為0.79%，0.81%。結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品測定

取本品3批，按照2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，按外標(biāo)法計算各組分的含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測波長選擇

利用二極管陣列檢測器對兩個對照品進(jìn)行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)芍藥苷、綠原酸分別在230 nm、327 nm處有最大吸收，芍藥苷在327 nm處幾乎無吸收，而綠原酸在230 nm處有部分吸收，但干擾較大，為更準(zhǔn)確、穩(wěn)定檢測目標(biāo)成分，故選擇230 nm為芍藥苷檢測波長，327 nm為綠原酸檢測波長。

3.2 多個因素考察

3.2.1 流動相的選擇 試用了不同比例的乙腈-水、乙腈-酸水及乙腈-酸水-三乙胺3種流動相，結(jié)果以乙腈- [（水- 磷酸-三乙胺（85:0.08:0.08 ）]（17:83）為流動相時分離效果最好。

3.2.2 提取溶劑的選擇 考察了水、乙醇、甲醇、50%甲醇的提取效果，結(jié)果以50%甲醇為溶劑提取效果最佳。

3.2.3 提取方法選擇 考察了超聲法和加熱回流法，結(jié)果差異不大，超聲法更簡便，故選擇超聲法提取。

3.2.4 提取時間確定 以50%甲醇為溶劑，分別超聲處理10，20，30，50 min，結(jié)果提取時間為30 min比10 min、20 min含量高，而與提取時間為50min的含量差異不大，故選擇提取時間為30min。

3.3 經(jīng)查閱文獻(xiàn)，楊芳[6]等用HPLC測定復(fù)肝寧片中綠原酸的含量及黃有帶等[7]用HPLC測定該制劑中柴胡皂苷a的含量。本研究建立的HPLC在同一色譜條件下，分別以兩個波長同時測定該制劑中兩種有效成分的含量，實現(xiàn)多指標(biāo)控制產(chǎn)品質(zhì)量，為完善復(fù)肝寧片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考，更有利于企業(yè)及監(jiān)管部門對產(chǎn)品進(jìn)行有效評價及監(jiān)控。