中藥材五靈脂特異性PCR鑒別方法的研究

馬德源，譚晴晴，陳力群，劉艷艷，葛付存，王佩儀，步 迅，陳雪燕，張全芳*

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術研究中心，山東 濟南 250100；2. 山東師范大學附屬中學，山東 濟南250014；3. 山東百味堂中藥飲片有限公司，山東 濟南 250108；4. 山西廣譽遠國藥有限公司，山西 晉中030800）

關鍵字：五靈脂；復齒鼯鼠；特異性；PCR；分子鑒定

要求，且相對誤差大。DNA基因鑒定近年在中藥鑒定中應用較為廣泛,該技術能從基因層面鑒別藥材,準確性較高[6]，而DNA條形碼鑒定技術作為新興的分子生物學鑒定技術，在中藥材領域取得豐碩成果[7]。COI 為線粒體基因組的蛋白質編碼基因，全稱為細胞色素 C 氧化酶亞基 I（cytochrome C oxidase subunit I），由于該基因進化速率較快，常用于分析親緣關系密切的種、亞種及地理種群之間的系統(tǒng)關系。陳士林等[8]在大量實驗的基礎上提出了以COI基因為主、ITS2基因為輔的動物類藥材DNA條形碼鑒定體系。由于五靈脂屬復齒鼯鼠的干燥糞便，放置時間較長，DNA含量少，提取相對困難。利用動物通用引物COI序列進行鑒定，部分物種會出現(xiàn)不同程度套峰，致使檢測結果不準確，且PCR擴增困難。本研究以五靈脂為研究對象，針對不同物種間序列差異性，利用線粒體16S rDNA基因片段對樣本五靈脂為復齒鼯鼠（Trogopterus xanthipes）的干燥糞便，始載于《開寶本草》，云：“出北地。此是寒號蟲糞也”[1]。五靈脂性味甘溫，無毒，入肝經(jīng)，具有疏通血脈、散瘀止痛的功效，主治血滯、經(jīng)閉、腹痛、胸脅刺痛跌撲腫痛和蛇蟲咬傷等癥，是婦科要藥[2]。然而，市場上部分藥材存在摻假問題，如用紅白鼯鼠、飛鼠科動物小飛鼠和黑白飛鼠、鼠兔科多種鼠兔的糞便冒充復齒鼯鼠的糞便，甚至部分不法分子利用小糞粒和沙粒及松樹葉碎片偽制成靈脂塊。這些偽品在外觀和質地上都與真正的五靈脂極其相似，形態(tài)鑒別困難。

目前，對五靈脂真?zhèn)蔚蔫b別主要通過形態(tài)學鑒定和有效成分檢測鑒定。傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定采用生藥鑒別和顯微鏡檢技術[3]，有效成分鑒定主要應用薄層色譜鑒別技術[4]和氣相色譜-質譜聯(lián)用分析技術[5]。這些傳統(tǒng)方法對樣品的完整度和干燥度有一定進行研究，通過分析比對相關序列，設計五靈脂特異性引物，旨在建立一種適用于中藥材五靈脂動物基源成分鑒定的新分子標記方法。

表1 樣品來源

1 儀器與材料

1.1 儀器

艾本德5333 PCR擴增儀（德國Eppendorf）；ABI 3700XL DNA測序儀（美國ABI公司）；5810多功能臺式離心機離心機（德國Eppendorf）；ChemiDoc? XRS+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2 材料

本研究所用的試驗樣品具體來源和信息見表1。市售的15個待測樣品購自濟南某中藥市場。OMEGA Stool DNA 試劑盒（OMEGA公司）；Taq DNA聚合酶，10×緩沖液， dNTP [寶生物（大連）]。

2 方法

2.1 DNA樣品提取

針對糞便DNA提取困難的特點，本試驗采用3種方法提取五靈脂基因組DNA，并進行比較。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗樣品2～3遍，加核酸裂解液消化，取上清，酚-氯仿抽提，然后分別按方法A、B、C處理。方法A[9]：向沉淀中加入 CTAB裂解液500 μl和蛋白酶K20 μl，混勻，55 ℃裂解2 h；12 000 r/min離心5 min，上清置入1.5 ml離心管，加等體積氯仿抽提，混勻，12 000 r/min離心10 min，反復抽提兩次（離心后使水相和有機相之間不再有沉淀）；向上清中加0.1倍體積的3 mol/L醋酸鈉，1.5倍預冷無水乙醇，混勻，-20 ℃放置30 min；12 000 r/min離心10 min，棄上清，室溫干燥；向沉淀中加異硫氰酸胍洗液1 ml，搖勻至沉淀完全溶解；加硅珠懸液20 μl，緩慢振搖吸附DNA10 min，12 000 r/min離心1 min，棄上清；加70%乙醇700 μl重復洗滌沉淀2次；離心棄上清，56 ℃干燥10 in，加雙蒸水40 μl洗脫DNA，離心后將上清置入新的離心管，-20 ℃保存待用。方法B[10]：向沉淀中加CTAB裂解液700 μl和蛋白酶K 20 μl，混勻，56 ℃裂解2 h；12 000 r/min離心10 min，上清置入1.5 ml離心管，加等體積氯仿抽提，混勻，12000 r/min離心10 min，反復抽提兩次（離心后使水相和有機相之間不再有沉淀）；加2倍體積的DNA結合液和10 μl硅珠懸浮液，12000 r/min離心1 min；棄上清，加70%無水乙醇700 μl洗滌2遍；12000 r/min離心1 min，棄上清，56℃干燥10 min，加雙蒸水 40 μl洗脫DNA，離心后將上清置入新的離心管，-20℃保存待用。方法C參考動物糞便提取試劑盒（OMEGA Stool DNA 試劑盒），具體操作步驟參照使用說明書。每份DNA樣品分別取2 μl，用紫外線分光光度計測定其濃度及A260、A280。每個樣品做3個生物學重復，取均值。并利用動物COI通用引物檢測DNA質量。

2.2 引物設計

選擇復齒鼯鼠的線粒體16S rRNA基因作為研究對象，在Genbank中查找該基因序列（登錄號：AY227494.1）。采用Premier Primer 5.0軟件設計特異引物，上游引物為Tr-16SF：5’-ACATTGACCTCTCCGTGAAGAG-3’，下游引物為Tr-16SR：5’-TTACACGATTTGGATGTCCTGAT-3’。通用引物COI序列擴增正向引物 HCO2198：5’-TAA ACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’，反向引物LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATT GG-3’。

2.3 PCR擴增和電泳檢測

通過預實驗對擴增條件和體系參數(shù)進行優(yōu)化。PCR擴增采用25 μl體系，其中包括：10×Taq Buffer 2.5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μl，DNA模板2.0 μl，雙蒸水補足至25 μl。PCR反應條件為：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。擴增結束后，取5.0 μl PCR擴增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。

2.4 特異性引物檢測

分別以從8份五靈脂、小家鼠糞便、黑白飛鼠糞便、紅白鼯鼠、紅耳鼠兔糞便和家兔糞便中提取的基因組DNA為模板，按2.3項優(yōu)化的反應體系和反應條件進行PCR擴增，檢測其Tr-16SF/R引物的特異性。

2.5 靈敏度檢測

對所提取的五靈脂的DNA模板進行質量濃度測定，確定DNA濃度為44.35 ng/μl，按10倍梯度進行稀釋（100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5），對所稀釋的DNA模板采用相同的PCR反應體系和條件進行擴增，檢測Tr-16SF/R引物的靈敏度。

2.6 數(shù)據(jù)分析

PCR擴增產(chǎn)物采用3730XL測序儀測序，然后將上下游序列通過Seq Man軟件進行拼接，拼接結果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對判斷檢測結果的準確性。

2.7 實際樣本檢測

利用本研究建立的PCR反應體系和條件對15份待測樣本進行特異性檢測。

3 結果

3.1 3種方法提取的基因組DNA純度和濃度檢測結果

結果見表2。由表2可見，方法B提取的DNA純度、濃度均優(yōu)于其他兩種方法。

表2 3種方法提取的基因組DNA純度和濃度檢測結果

3.2 COI通用引物檢測DNA模板質量

圖1 COI通用引物的PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測圖

利用COI通用引物對模板進行擴增，檢測DNA提取質量。通用引物可擴增出一條約700 bp條帶，見圖1。由圖1可見，提取的DNA質量均能達到擴增要求，可用于后續(xù)試驗。

3.3 PCR擴增體系建立

對收集到的8個五靈脂樣品進行特異性PCR檢測，以無菌水和鼠屬偽品作為陰性對照，見圖2。結果顯示，五靈脂為陽性，擴增出預期340 bp左右的條帶。擴增產(chǎn)物測序結果見圖3。擴增序列拼接后進行Blast分析，結果顯示所擴增的序列與復齒鼯鼠的相似度99%，說明本方法能快速檢測出五靈脂。

圖2 五靈脂特異性引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測圖

圖3 五靈脂特異性引物的PCR擴增產(chǎn)物測序序列峰圖

3.4 特異性檢測

對收集到的13份樣品，按建立的特異性PCR方法進行鑒別，結果見圖4。由圖4可見，1～8號有擴增條帶，且非常清晰，純度較高，鑒定為正品五靈脂；其他樣品無條帶，擴增結果為陰性，鑒定為非五靈脂正品。

圖4 五靈脂特異性驗證電泳檢測圖

3.5 靈敏度檢測

靈敏度檢測結果見圖5。由圖5可見，當DNA模板濃度稀釋至4.43 ng/μl時，特異性條帶擴增明顯且單一，當DNA濃度稀釋至0.443 ng/μl時，能微弱地看出擴增條帶但相對模糊，之后的稀釋模板均無擴增條帶產(chǎn)生。由此說明五靈脂特異引物的檢測靈敏度達4.43 ng/μl。

圖5 五靈脂特異性引物靈敏度檢測圖譜

3.6 實際樣品檢測

對15份待測樣本進行特異性PCR檢測，結果顯示，10份樣本檢測出復齒鼯鼠源性，5份樣本未檢出復齒鼯鼠源性成分，見圖6。

圖6 市場盲樣檢測凝膠電泳圖

4 討論

五靈脂是糞便類中藥材，由于保存時間長短不一且DNA降解嚴重，陳舊的糞便很難提取到高質量的DNA，而DNA提取的質量直接影響到后續(xù)PCR擴增及相關分子檢測工作。由于糞便的干燥程度不同，提取過程中無法通過刮取表面黏稠層，洗脫表面表皮細胞進行提取，只能將糞便搗碎混勻，吸取少量的樣品進行DNA提取。通過這種方法收集的細胞很少，且?guī)в写罅康碾s質。目前對于糞便提取常用的方法有試劑盒法、常規(guī)提取法、Chelex-100煮沸法和硫氰酸胍裂解法[11]。本研究根據(jù)五靈脂的特點，在DNA提取前先用PBS沖洗2～3次，直至沖洗液顏色變淺，從提取的基因組DNA濃度看，方法B的提取濃度高于方法A和C，且純度高，能很好地擴增出目的片段，滿足后續(xù)實驗的要求。同時，方法B相對于方法A、C耗時較短且操作簡單。方法A雖然也能獲取較高濃度的基因組DNA，但耗時較長，方法C屬于試劑盒提取，試劑費用相對較高。五靈脂在干燥或成粉末后特征不明顯，通過傳統(tǒng)方法很難鑒定。隨著分子生物學的發(fā)展，基源鑒定成為中藥標準化和重要研究的基礎[12]。本研究結果表明，引物Tr-16SF/R對五靈脂的檢測有較強的特異性，應用該引物可實現(xiàn)其近緣物種快速準確鑒別，且不受材料完整度、干燥程度的影響。