脂氧素A4降低LPS致肥胖大鼠炎性因子的釋放

吳 銘，蔣葦葦，高莉莉*

(1.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 兒科， 江蘇 徐州 221002； 2.徐州醫(yī)科大學， 江蘇 徐州 221004)

肥胖作為一種慢性代謝性疾病，已經(jīng)成為全球關(guān)注的健康問題。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人類生活水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)和生活方式發(fā)生了很大的改變，兒童肥胖在全球呈逐年增加的趨勢，已引起全世界的關(guān)注。有研究表明，肥胖嚴重影響了兒童的身心健康，也導致了一些成人疾病，如2型糖尿病、心血管系統(tǒng)疾病、部分惡性腫瘤等在兒童身上提前發(fā)生或發(fā)病率增加[1]。脂氧素A4(lipoxin A4； LXA4)作為一種具有抗炎、促炎性反應(yīng)消退功能的內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)，在免疫應(yīng)答過程中的許多環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要的負性調(diào)節(jié)作用，對肥胖也有較好的良性調(diào)節(jié)作用[2]。本實驗擬通過建立LPS致肥胖大鼠炎性反應(yīng)模型，通過對血清炎性因子以及對NF-κB及MAPK下游信號通路活化情況的檢測，驗證LXA4對肥胖及炎性反應(yīng)的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級健康雄性3周齡SD大鼠60只，體質(zhì)量30～50 g，徐州醫(yī)科大學實驗動物中心。合格證號：SCXK(蘇)：2010-0003。飼料：高脂飼料委托徐州醫(yī)科大學實驗動物中心加工(配方：10.0%豬油、5.0%蛋黃、2.0%膽固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.2%膽鹽和82.6%普通飼料)。

1.1.2 主要試劑：LXA4(Cayman公司)；LPS、β-actin Ab(Sigma-Aldrich公司)、大鼠IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(eBioscience公司)；P-NF-κB p65(Ser536)rabbit mAb、NF-κB p65(C22B4)rabbit mAb、P-P38 MAPK(Thr180/Tyr182)rabbit mAb、p38 MAPK Ab、P-IκBα(Ser32/36)mouse mAb、IκBα(L35A5)mouse mAb、Phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204) (E10) mouse mAb、p44/42 MAPK(Erk1/2)(137F5) rabbit mAb、Phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)(G9) mouse mAb、JNK2(56G8) rabbit mAb(CST公司)；兔二抗、鼠二抗(Jackson公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理： 將大鼠隨機分為普通飼料(normal diet，ND)和高脂飼料(high fat diet，HFD)組。6周后，以HFD組大鼠質(zhì)量超過ND組質(zhì)量的20%作為肥胖大鼠，再分別將兩組大鼠分成對照組、LPS組、LXA4組。LPS組予LPS 3 mg/kg腹腔注射；LXA4組予LPS 腹腔注射后，LXA4 10 μg/kg對側(cè)腹腔注射。操作完畢后觀察12 h，未達到觀察時間點而死亡者予以剔除。留取血清及肝臟組織，用于ELISA及Western blot實驗，每組8只大鼠。

1.2.2 ELISA檢測血清炎性細胞因子： 按照ELISA試劑盒操作說明書步驟進行操作，酶標儀測定標準品及各組樣品A值，繪制標準曲線，利用ELISACalc軟件對各組IL-6、TNFα進行定量。

1.2.3 Western blot檢測肝臟組織NF-κB及MAPK信號通路活化情況： 肝臟組織研磨后加入裂解液提取組織蛋白，并行超聲破碎，使用BCA試劑盒進行蛋白定量，10%的SDS-PAGE恒壓電泳(濃縮膠電壓60 V，分離膠電壓110 V)，恒流230 mA轉(zhuǎn)膜60 min至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗4 ℃過夜，次日TBST洗滌后加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，洗膜后顯影，使用Image J軟件分析吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清炎性細胞因子的釋放

HFD組較ND組大鼠IL-6和TNFα的釋放量明顯增加；ND組和HFD組大鼠，LPS注射后IL-6及TNFα的釋放明顯增加，而使用LXA4干預(yù)后可以明顯降低IL-6及TNFα的釋放(圖1)。

*P<0.05 compared with control group； #P<0.05 compared with LPS group；△P<0.05 compared with ND group圖1 各組大鼠血清炎性因子水平的比較Fig 1 Comparison of serum levels of inflammatory

2.2 Western blot檢測各組大鼠肝臟組織NF-κB及MAPK信號通路活化情況

HFD較ND組大鼠的NF-κB p65、IκBα以及MAPK p38、ERK1/2、JNK磷酸化水平出現(xiàn)增強。ND組大鼠，LPS亞組的NF-κB p65、IκBα、MAPK p38、ERK1/2的磷酸化水平較對照亞組明顯升高；而HFD組大鼠，LPS亞組的NF-κB p65、MAPK p38、ERK1/2以及JNK的磷酸化水平較對照亞組明顯下降，IκBα的磷酸化水平卻呈明顯增高。LXA4的干預(yù)可降低LPS致ND及HFD組NF-κB及MAPK信號通路的活化(圖2)。

3 討論

肥胖不僅僅是脂肪組織的堆積，它伴隨著一種慢性低度炎性反應(yīng)，稱之為“代謝性炎性反應(yīng)”，脂肪細胞的功能紊亂可引起全身性的炎性反應(yīng)[3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，幼年肥胖大鼠處于細胞免疫紊亂狀態(tài)；且肥胖大鼠脂肪組織內(nèi)炎性因子IL-6、TNFα和CRP的mRNA表達也較正常體質(zhì)量組明顯升高[4]。脂肪細胞中存在Toll樣受體4(TLR4)的信號通路，LPS作為TLR4的主要配體，可通過一系列級聯(lián)反應(yīng)，激活NF-κB信號通路，啟動TNF-α及IL-6細胞因子基因轉(zhuǎn)錄，誘導炎性細胞激活，導致多種促炎因子的合成和釋放[5]。上述研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠較正常體質(zhì)量大鼠的NF-κB和MAPK信號通路明顯活化。正常體質(zhì)量大鼠在LPS的作用下，炎性反應(yīng)信號通路明顯活化；而肥胖大鼠在LPS的作用下，僅IκBα的磷酸化水平增強，NF-κB p65、p38、JNK和ERK的磷酸化水平反而減弱。這可能與肥胖本身長期存在慢性炎性反應(yīng)，因而對LPS的刺激不敏感有關(guān)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with LPS group；△P<0.05 compared with ND group圖2 Western blot 檢測各組肝組織NF-κB及MAPK下游信號通路的活化

LXA4作為花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，是第一個被發(fā)現(xiàn)的具有廣泛的抗炎、促炎癥消退功能的內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)，被譽為炎性反應(yīng)的“剎車信號”[6]。LXA4 能夠與其耦聯(lián)受體結(jié)合，通過多種信號通路下調(diào)炎性因子在組織中的表達。LXA4能夠抑制白細胞向炎性反應(yīng)部位的趨化，并促進巨噬細胞吞噬凋亡的粒細胞和其他損傷細胞，從而抑制炎性反應(yīng)的過程并促進炎性反應(yīng)的消散[7]。LXA4還可以減輕肥胖相關(guān)的脂肪組織的炎性反應(yīng)，恢復(fù)巨噬細胞的功能，并恢復(fù)脂肪組織自噬標志物LC3-Ⅱ和p62的表達[2]。課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，LXA4可以減少脂肪組織內(nèi)IL-6、TNFα和CRP的mRNA表達水平，并可有效降低血清炎性因子的濃度[4]。上述實驗發(fā)現(xiàn)LXA4可有效降低LPS引起的ND、HFD組大鼠血清炎性因子的升高，并可有效降低NF-κB p65、IκBα、MAPK p38、ERK1/2以及JNK的磷酸化水平。NF-κB及MAPK信號通路是體內(nèi)重要的炎性反應(yīng)信號通路。LXA4可有效降低LPS引起的NF-κB及MAPK信號通路的活化，并可顯著減少炎性因子的釋放。因此，有理由推測LXA4可能是通過抑制NF-κB及MAPK信號通路的活化來發(fā)揮對炎性反應(yīng)的保護作用。

LXA4為內(nèi)源性抗炎介質(zhì)，對肥胖及炎性反應(yīng)具有雙重調(diào)節(jié)作用，本研究有望為臨床上肥胖合并嚴重炎性反應(yīng)的治療提供新的思路。