乙型肝炎病毒反式激活因子XTP4促進(jìn)肝癌細(xì)胞系遷移和侵襲

鄧秀娟，韓 銘，劉順愛，成 軍*，梁躍東*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550004；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院 傳染病研究所， 北京 100015)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤，以亞洲和非洲高發(fā)[1- 2]。中國也是世界上HCC高發(fā)地區(qū)，位于常見腫瘤第3位，每年發(fā)病人數(shù)約30萬人。手術(shù)切除仍是治療早期肝癌的最佳選擇，許多臨床研究表明，肝癌根治性切除后病死率可下降至5%以下，但60%～70%的患者術(shù)后5年內(nèi)會發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[3]。癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是癌致死的首要原因[4]，明確轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的生物指標(biāo)，提供靶向治療是目前的迫切任務(wù)。隨著研究的深入，關(guān)于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究有了很大的進(jìn)展，提出了多種多樣的新概念[5- 6]。本課題組于2004年篩選克隆了乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4(HBX protein trans-activate gene， XTP4)[7]。近年來研究表明XTP4與乳腺癌、前列腺癌和肝癌等多種腫瘤密切相關(guān)[8- 9]，并在腫瘤分級分期和化療耐藥、過度增殖和轉(zhuǎn)移侵襲等中發(fā)揮作用[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，XTP4可通過調(diào)控Bcl- 2/Bax表達(dá)，抑制HepG2細(xì)胞的凋亡，參與HBV致病過程[10]。本研究旨在探討XTP4對肝癌細(xì)胞遷移侵襲的影響，明確XTP4是否參與肝癌轉(zhuǎn)移過程，是否有望成為肝癌的靶向治療新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和siRNA：人來源肝癌細(xì)胞系HepG2、過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4真核質(zhì)粒以及對照pcDNA3.1/myc-His(-)A質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室(首都醫(yī)科大學(xué)附屬地壇醫(yī)院傳染病研究所)保存；siXTP4、與目的序列無同源性的通用陰性對照組siNC(上海制藥技術(shù)有限吉瑪公司合成)；課題組前期已經(jīng)篩選出干擾效果較好的序列，序列如下：siNC:正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGU CACGUTT-3；反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGA ATT-3′；siXTP4:正義鏈5′-UCUGGGUUCCUGCUCU GUUTT-3′；反義鏈5′-AACGCAGGAACCCAGATT-3′。

1.1.2 試劑：細(xì)胞DMEM原液和胎牛血清FBS(Life Technology公司)；青霉素和鏈霉素(BD公司)；jetPRIMETM(Polyplus Transfection公司)；總RNA提取試劑盒(Omega公司)；兔抗人XTP4抗體(Abcame公司)；抗-GAPDH、山羊抗兔IgG-HRP和山羊抗鼠IgG-HRP(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的重培養(yǎng)與提?。赫婧吮磉_(dá)載體pcDNATM3.1/myc-His(-)A-XTP4由本課題組前期構(gòu)建成功保存；取菌液加入裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃搖床250 r/min，12 h過夜搖菌；分別取滅菌處理后的200 mL LB培養(yǎng)基和小搖菌液1 mL于錐形瓶中，37 ℃搖床250 r/min，16 h過夜搖菌；按照中提試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒的提??；最后將提出的質(zhì)粒送奧科測序公司進(jìn)行測序，并與NCBI原序列進(jìn)行比對。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代分組處理：將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于5% CO2孵箱中37 ℃培養(yǎng)；待細(xì)胞增殖至匯合度為80%～100%時(shí)即可分板處理，分別轉(zhuǎn)染過表達(dá)和干擾質(zhì)粒以及各自的對照質(zhì)粒，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Real-time PCR檢測基因表達(dá)：HepG2培養(yǎng)48 h后,按照試劑盒Total RNA Kit說明書提取細(xì)胞中的總RNA(均為RNase-free操作)；將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，根據(jù)Power SYBR?Green PCR Master Mix說明書檢測相關(guān)基因在細(xì)胞的表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測XTP4、snail、NF-κB和MMP- 9的表達(dá)：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot;取蛋白質(zhì)樣品電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，于1×TBST配制的5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；分別加入相應(yīng)一抗，4 ℃過夜，1×TBST洗膜3次；加二抗置室溫2 h，1×TBST洗膜3次；配制顯色液后將膜于成像儀下曝光顯影。

1.2.5 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，在板底背面用記號筆畫平行標(biāo)記線，待細(xì)胞增殖至匯合度為90%～100%時(shí)，中號槍頭板內(nèi)畫垂直于板底記號線的劃痕線，兩線交叉點(diǎn)作為觀察點(diǎn)，PBS洗掉脫落細(xì)胞，換上無血清培養(yǎng)基，拍照測量交叉點(diǎn)“傷口距離”，記為0 h，分別在24和48 h同位點(diǎn)拍照，每組取3個(gè)數(shù)值，進(jìn)行比較。

1.2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：6板培養(yǎng)細(xì)胞，干預(yù)處理48 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸，Transerll小室(上室濾膜無Matrigel膠包被)上室加入100μL含有5×104個(gè)細(xì)胞的無血清懸液，下室加入600 μL 20%胎牛血清培養(yǎng)基，于5% CO2， 37 ℃孵箱中培養(yǎng)24、36和48 h，取出24孔板，用棉簽擦掉上室未穿過細(xì)胞，100%甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min,倒置顯微鏡高倍視野(×200，5個(gè)視野)拍照觀察穿膜細(xì)胞數(shù)量，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 XTP4的重組真核質(zhì)粒測序正確

重培養(yǎng)pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4質(zhì)粒序列測序正確，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可用此序列進(jìn)行XTP4基因過表達(dá)。

2.2 XTP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后效率鑒定

2.2.1 重組真核質(zhì)粒過表達(dá)效果檢測：重組真核質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4成功過表達(dá)肝癌細(xì)胞中XTP4 mRNA(圖1A)(P<0.05)；成功增加了XTP4蛋白表達(dá)水平(圖1B)。

2.2.2 小干擾質(zhì)粒XTP4 siRNA干擾效果檢測：小干擾質(zhì)粒XTP4 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后， XTP4 siRNA成功降低了HepG2中XTP4 mRNA的表達(dá) (圖2A)(P<0.01)；成功減少了XTP4蛋白表達(dá)水平(圖2B)。

2.3 XTP4基因能夠促進(jìn)HepG2遷移

2.3.1 對細(xì)胞橫向遷移能力的影響:過表達(dá)組XTP4的遷移率較對照組增加(P<0.05)，干擾組遷移率低于對照組(P<0.01)，說明XTP4可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移侵襲能力(圖3)。

2.3.2 對細(xì)胞縱向遷移能力的影響:重組真核質(zhì)粒、小干擾質(zhì)粒處理的細(xì)胞接種上室，24 h后表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)多于對照組(P<0.05)(圖4A)；干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少(P<0.01)(圖4B)。

2.4 qRT-PCR和Western blot檢測Snail、NF-κB和MMP- 9 mRNA及蛋白的表達(dá)

小干擾質(zhì)粒處理HepG2 48 h后，干擾組Snail和NF-κB的mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)(圖5)。

A.verification of XTP4 mRNA level in hepatocellular carcinoma cells after XTP4 transfection; B.XTP4 protein level of hepatocellular carcinoma cells after XTP4 transfection; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.XTP4 mRNA level of hepatocellular carcinoma cells with XTP4 small interfering plasmid; B.XTP4 protein level of hepatocellular carcinoma cells with XTP4 small interfering plasmid; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.overexpression of XTP4 gene after the wound healing test, respectively, after the scratch treatment 0,24,48 hours; B.interference of XTP4 gene after the wound healing test, respectively, after the scratch treatment; *P<0.05 compared with control group

3 討論

XTP4是位于人類染色體17q12上的新基因，位于含有多種基因的“癌熱點(diǎn)基因座”中，已證明這些基因參與了癌的發(fā)展。XTP4位于HER2擴(kuò)增子的最小擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)， 介于HER2和GRB7之間， XTP4的開放閱讀框編碼大小為12.4 ku、表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)。XTP4在肝癌腫瘤轉(zhuǎn)移生物學(xué)中的作用尚未被研究，本課題將研究XTP4對肝癌細(xì)胞遷移侵襲的影響。

A.transplantation of XTP4 gene in hepatocellular carcinoma cells was performed in Transwell chamber and 24 hours after taking pictures, the number of cells passing though the cell membrane increased significantly, *P<0.05 compared with control group; B.after silencing the XTP4 gene in hepatocellular carcinoma cells, Transwell test was performed and 24 hours after taking pictures, the number of cells passing thought the cell membrane was significantly decreased; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.Snail mRNA expression; B.NF-κB mRNA expression; C.MMP- 9 mRNA expression; D.NF-κB, MMP- 9 expression at the protein level; *P<0.05 compared with control group

肝癌是一種常見的預(yù)后較差的實(shí)質(zhì)性腫瘤。將近90%的腫瘤相關(guān)死亡歸因于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟連續(xù)性過程，由特定信號分子通過控制細(xì)胞骨架動力學(xué)和細(xì)胞間黏附和/或細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的變化途徑啟動和維持，其中腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和細(xì)胞外基質(zhì)降解是重要步驟，最終導(dǎo)致細(xì)胞向鄰近組織遷移和外滲[11]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明XTP4對肝癌的增殖凋亡密切相關(guān)，通過大量查詢TCGA數(shù)據(jù)庫資料結(jié)果表明，XTP4在肝癌組織中呈高表達(dá)，在癌旁及正常組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，可以初步證實(shí)XTP4可能為理想的肝癌診斷標(biāo)志分子。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)XTP4可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞遷移速率增加，干擾XTP4的表達(dá)可使HepG2細(xì)胞遷移速率減慢，這一發(fā)現(xiàn)與先前在前列腺癌細(xì)胞中的報(bào)道一致[12]。表明沉默XTP4基因在肝癌治療中有實(shí)際應(yīng)用前景。

NF-κB是重要的可誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，近年來研究表明,NF-κB調(diào)節(jié)許多黏附、侵襲、遷移相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄而參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，在調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，阻斷NF-κB信號通路可下調(diào)MMP- 9及上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑- 1、2(TIMP- 1、2)表達(dá)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程被認(rèn)為參與促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程，近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Snail是參與EMT調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過與上皮鈣黏素啟動中區(qū)的E2BOX連接基序結(jié)合，抑制其的轉(zhuǎn)錄表達(dá)誘導(dǎo)EMT發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究在肝癌細(xì)胞沉默XTP4后,在轉(zhuǎn)錄水平檢測Snail表達(dá)量有所下降，但是在蛋白水平暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯改變，還需要進(jìn)一步的研究，Snail有可能會充當(dāng)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的另一個(gè)靶向標(biāo)志物。

綜上所述，XTP4通過增加NF-κB的表達(dá)發(fā)揮基因調(diào)控作用,增強(qiáng)MMP- 9基因的轉(zhuǎn)錄活性,使MMP- 9表達(dá)上調(diào),增加基底細(xì)胞膜降解，引發(fā)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。因此XTP4可能作為肝癌的靶向治療目標(biāo)基因，NF-κB和MMP- 9表達(dá)的檢測可能有助于肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的判斷。隨著XTP4作用機(jī)制進(jìn)一步研究，XTP4有望能在肝癌預(yù)測以治療當(dāng)中發(fā)揮潛在作用。