阿帕替尼治療小鼠人源化胃癌移植瘤模型的療效觀察及CD31的意義

陳祖華，張朦琦，高 靜，章 程，李艷艷，沈 琳

(北京大學腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所 消化腫瘤內科 惡性腫瘤發(fā)病機制及轉化研究教育部重點實驗室， 北京 100142)

腫瘤的發(fā)生需要新生血管的形成，抗腫瘤血管靶向治療是腫瘤靶向治療的重要研究方向[1]。阿帕替尼是中國首個自主研發(fā)的血管靶向藥物，于2016年被國家食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)正式批準用于進展期胃癌的三線治療，這也是中國唯一可用于胃癌的血管靶向藥物。雖然阿帕替尼(apatinib)是靶向VEGFR2的小分子酪氨酸激酶抑制劑，但阿帕替尼的獲益人群目前尚不清楚，且其與化療聯合的協(xié)同性也尚不明確。本研究旨在運用可高度還原患者腫瘤特征的人源化胃癌移植瘤(patients-derived xenograft,PDX)模型[2-3]，探索阿帕替尼的可能療效預測標志物及與化療藥物紫杉醇(paclitaxel, PTX)聯合的可行性，為后續(xù)臨床試驗提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

6例胃癌小鼠PDX模型；甲磺酸阿帕替尼(純度>99.9%，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；紫杉醇注射液(北京協(xié)和藥廠)；DNA提取試劑盒(Qiagen公司)；Trizol(Invitrogen公司)；4%甲醛固定液和無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；30% H2O2溶液、羊血清、磷酸鹽緩沖液和兔屬通用型二抗工作液(北京中杉金橋有限公司)；兔抗鼠CD31抗體(Cell Signaling Technology公司)； SPF級5～6周齡的雌性非肥胖糖尿病/嚴重聯合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胃癌PDX模型的建立與傳代：本研究相關動物實驗經北京大學腫瘤醫(yī)院獨立倫理委員會批準，并在實驗動物管理與使用指南下進行。本實驗所有程序均在無特定病原體設施的無菌條件下進行。人源化胃鏡活檢胃癌PDX模型的建立與傳代如前期報道[3]。

1.2.2 實驗分組與用藥：當腫瘤體積達到100～150 mm3時，小鼠被隨機分配至不同組(每組5只小鼠)。1)對照組：0.9%氯化鈉溶液，灌胃，每天1次；腹腔注射，每周2次；2)阿帕替尼單藥組：阿帕替尼150 mg/kg，灌胃，每天1次；3)紫杉醇單藥組：紫杉醇5 mg/kg，腹腔注射，每周2次；4)阿帕替尼聯合紫杉醇組：劑量及給藥方式同單藥。分組當日給藥，每次給藥前測量小鼠的質量。

1.2.3 腫瘤生長抑制率的計算：小鼠給藥過程中，每隔2 d用精密游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑(L, length)與寬徑(W, width)，按公式V(volume)=(W2×L)/2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。給藥結束后，頸椎脫臼處死小鼠，腫瘤生長抑制率(tumor growth inhibition, TGI)= 1-ΔT/ΔC×100%(ΔT=治療結束時藥物治療組的腫瘤體積變化，ΔC=治療結束時對照組的腫瘤體積變化)。

1.2.4 靶向捕獲測序及轉錄測序檢測PDX腫瘤組織的分子變異及表達情況：用組織DNA提取試劑盒分別提取6例PDX模型腫瘤組織的基因組DNA，Trizol法提取PDX 1對照組和用藥組腫瘤組織的總RNA，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行DNA靶向測序、轉錄組測序及生物信息學分析。

1.2.5 免疫組織化學檢測CD31的表達：用藥結束后分離胃癌PDX腫瘤組織，免疫組織化學檢測和分析CD31的表達如前期報道所述[4]。CD31的表達由Aperio ImageScope軟件v8.2.5分析，定義為受檢腫瘤組織內皮細胞中CD31陽性細胞的百分比。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 阿帕替尼單藥及聯合紫杉醇在晚期胃癌PDX模型中的療效

與溶劑對照組相比，阿帕替尼單藥在6例PDX模型中均顯示出不同程度的抑瘤作用，抑瘤效果也優(yōu)于紫杉醇單藥，尤其在PDX 1-3模型中阿帕替尼抗腫瘤作用高于PDX 4～6模型。與阿帕替尼單藥組相比，阿帕替尼聯合紫杉醇僅在PDX 5模型中具有更顯著的抗腫瘤作用(P<0.001)(圖1，表1)。

A.efficacy of apatinib, paclitaxel and combination group in six PDX models for gastric cancer, *P<0.05 compared with control group; B.tumor size of PDX models in each group

表1 阿帕替尼在6例胃癌PDX中的抑瘤作用

2.2 阿帕替尼處理前后血管生成相關基因的變異及表達情況

血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)以及血小板衍生生長因子(PDGF)及其受體是腫瘤血管生成的3類重要調節(jié)因子。在6例分子特征明確的PDX模型中，僅PDX 2模型攜帶FGFR2 A333V的單核苷酸變異，未檢測到VEGF/VEGFR、FGF/FGFR和PDGF/PDGFR等血管生成相關基因的突變或拷貝數變異(圖2A)。

阿帕替尼用藥組與對照組腫瘤組織的相關系數R2=0.97，表明兩組腫瘤組織相關性較高。與對照組腫瘤相比，阿帕替尼用藥組檢測到包括FGFR1/2在內的1 230個顯著下調基因(圖2B)。GO(gene ontology)分析顯示差異基因主要富集在血管生成(vasculature development)、血液循環(huán)(blood circulation)、炎性反應(inflammatory response)和蛋白級聯激活(protein activation cascade)等生物過程(圖2C)。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析顯示差異基因顯著富集于補體和凝血級聯(complement and coagulation cascades)信號通路(圖2D)。

2.3 阿帕替尼在胃癌PDX模型中的療效與CD31的表達相關

與溶劑對照組相比，CD31表達較高的PDX腫瘤組織對阿帕替尼的敏感性高于CD31表達較低的組織，且阿帕替尼對新生血管生成有抑制作用(圖3，表2)。這提示CD31的表達(微血管密度)或許是潛在的預測阿帕替尼療效的標志物之一。

3 討論

本課題組前期研究發(fā)現，阿帕替尼在CD31表達較高的胃癌PDX模型中更為敏感[4]。本研究進一步擴大模型樣本，證實阿帕替尼在胃癌PDX模型中通過抑制血管生成發(fā)揮其抗腫瘤作用，且藥物處理后腫瘤組織中的CD31表達水平明顯降低， 這與既往文獻報道[5]一致?？筕EGFR2酪氨酸激酶抑制劑處理可導致腫瘤微血管的顯著減少，并進一步減少腫瘤組織的血供，從而導致腫瘤細胞的壞死或凋亡[5]。

A: SNV.single nucleotide variation, InDel.insertion/deletion, CNV.copy number variation; B: red dots, significantly upregulated genes; green dots, significantly downregulated genes; C:go enrichment of differentially expressed genes; D:KEGG enrichment of differentially expressed genes

圖3 阿帕替尼治療前后胃癌PDX模型中CD31的表達Fig 3 CD31 expression of PDX models before and after apatinib treatment(×40 magnification; scale bars=100 μm)

表2 阿帕替尼治療前后CD31的表達情況Table 2 CD31 expression of six PDX models before and after apatinib treatment %，n=3)

阿帕替尼目前已被CFDA批準用于晚期胃癌三線及三線以上治療。阿帕替尼跟常規(guī)化療聯用效果如何？如何篩選阿帕替尼獲益群體？是目前研究的熱點。在RAINBOW研究中，雷莫蘆單抗聯合紫杉醇在晚期胃癌二線治療中顯示出優(yōu)于雷莫蘆單抗單藥的抗腫瘤作用[6]，有學者提出阿帕替尼聯合紫杉醇在臨床實踐中的可行性[7]。然而在本研究中，阿帕替尼聯合紫杉醇在胃癌PDX模型中并無明顯協(xié)同抗腫瘤作用，臨床聯合用藥的可行性低，該結論尚需進一步驗證。

既往報道了多項與抗血管生成治療相關的療效標志物[8]。神經纖毛蛋白-2 (neuropilin-2)的mRNA水平與貝伐珠單抗的PFS呈負相關[9]，VEGFA的高表達與更長的OS相關，VEGFR2的高表達與更短的PFS相關[10]。然而，上述研究僅在非亞洲地區(qū)的患者中發(fā)現有統(tǒng)計學意義。近期，一項基于269例接受阿帕替尼治療的轉移性胃癌患者的回顧性隊列研究表明，首次接受阿帕替尼治療期間高血壓、蛋白尿或手足綜合征的出現是阿帕替尼的可行療效預測標志物[11]。本研究首次利用前期建立的人源化胃鏡活檢移植瘤模型，發(fā)現阿帕替尼單藥在胃癌PDX中的抑瘤作用具有選擇性。與CD31低表達的PDX模型相比，CD31表達水平高的PDX模型對阿帕替尼更為敏感，有待后續(xù)進一步驗證。除此之外，其他可能的療效預測生物標志物尚需繼續(xù)探索。