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    β受體拮抗劑對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷的保護(hù)作用

    2018-12-14 05:29:36洪澄英陳懷生曹靜杜玉洛劉雪燕李威
    關(guān)鍵詞:艾司拮抗劑洛爾

    洪澄英,陳懷生,曹靜,杜玉洛,劉雪燕,李威

    (暨南大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)院,深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,廣東 深圳 518020)

    膿毒癥是嚴(yán)重感染所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征[1],病情發(fā)展常可引起多臟器功能衰竭,病死率達(dá)20%~30%[2]。研究顯示約60%膿毒癥患者出現(xiàn)心功能不全[3-4],而合并心功能不全患者病死率高[5]。目前研究[6]認(rèn)為,心肌線粒體功能損傷是膿毒癥患者心功能不全的主要原因之一,修復(fù)心肌線粒體功能可能對(duì)膿毒癥心功能不全有一定緩解作用。有研究[7]表明β受體拮抗劑有助于改善膿毒癥所致的心肌損害。評(píng)估β受體拮抗劑治療膿毒癥患者的療效和安全性的研究表明β受體拮抗劑不增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[8],并有可能有益于患者的預(yù)后[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10]也表明β受體拮抗劑可以抑制膿毒癥模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡、改善血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。本研究探討β受體拮抗劑對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能的影響。

    1 材料與方法

    1.1 大鼠模型建立和分組

    SD雄性大鼠20只,體質(zhì)量250~350 g,購(gòu)自國(guó)家動(dòng)物實(shí)驗(yàn)種子中心上海分中心暨上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前 20~25 ℃和60%濕度條件下12 h光照/12 h黑暗交替,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。然后按照簡(jiǎn)單隨機(jī)數(shù)字法分為4組,每組5只,分別為對(duì)照組、模型組、美托洛爾組和艾司洛爾組。對(duì)照組大鼠不做處理。其余3組參考文獻(xiàn)[11]采用小劑量?jī)?nèi)毒素持續(xù)注射誘導(dǎo)建立膿毒癥模型:根據(jù)大鼠體質(zhì)量準(zhǔn)備內(nèi)毒素( 10 mg/kg) ,加生理鹽水溶解為10 mL,經(jīng)大鼠尾部靜脈注射[0.42 mL/( kg·h) ]并持續(xù)24 h。建模成功后美托洛爾組經(jīng)尾注射美托洛爾0.05 mg( 沖擊量) ,然后持續(xù)注射美托洛爾[0.2 mg/( kg·h) ][12];艾司洛爾組經(jīng)尾注射艾司洛爾[15 mg/( kg·h) ][13];模型組注射等量的生理鹽水。各組均持續(xù)治療48 h。

    1.2 檢測(cè)指標(biāo)

    (1) 模型成功驗(yàn)證:記錄各組大鼠精神狀態(tài)、生活習(xí)慣、體溫,眼眶靜脈取血檢測(cè)白細(xì)胞 (white blood cell,WBC)數(shù) (血常規(guī)分析儀) ,腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α) 、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6) 水平 (ELISA) 。 (2) 治療前 (0 h) 、治療24 h和48 h后檢測(cè)各組大鼠心率、平均動(dòng)脈血壓; (3) 治療48 h后,處死大鼠,取心肌組織切片行病理學(xué)檢測(cè) (HE染色,電子顯微鏡下觀察各組線粒體); (4) 治療48 h后,采用qPCR和Western blotting分別檢測(cè)各組線粒體內(nèi)膜特異的腺甘酸轉(zhuǎn)移酶 (adenosine transferase,ANT) mRNA和蛋白表達(dá)水平。

    1.2.1 ELISA檢測(cè):眼眶靜脈取血 (0.3 mL) ,采用離心機(jī)3 000 r/min 4 ℃離心10 min,然后-80 ℃冰箱保存。采用ELISA試劑盒 (美國(guó)R&D公司) 檢測(cè)各組血清中TNF-α、IL-6表達(dá)水平,所有操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.2.2 qPCR檢測(cè):將大鼠心肌組織在液氮中迅速磨碎,加入1 mL Trizol溶液,上下顛倒混勻,室溫放置10 min使組織充分裂解;加入0.2 mL氯仿,上下顛倒混勻,室溫放置5 min,溶液分成上下兩層;4 ℃ 12 000 r/min離心15 min;小心吸取上層清液( 約0.6 mL) 到新的離心管中;加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇,輕柔顛倒混勻后室溫放置5 min,觀察白色沉淀析出;4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,倒掉上清液,收集RNA沉淀;加入1 mL 75%乙醇( DEPC水稀釋) 洗滌RNA,7 500 r/min離心5 min( 4 ℃);棄去乙醇,吹干后加入20~100 μ L的RNase-free或高溫滅菌的DEPC水溶解;取1 μ L樣品測(cè)定樣品濃度以及純度,260/280在1.8~2.0之間,260/230在2.0~3.0之間為佳;取約100 ng RNA用于瓊脂糖膠電泳,檢測(cè)其是否降解;RNA樣品-80 ℃保存?zhèn)溆?。去除DNA雜質(zhì),在RNase-free或DEPC處理過的200 μ L離心管中,配制如下反應(yīng)體系,95 ℃處理3 min或70 ℃處理15 min,使RNA聚合酶失活,合成獲得cDNA第一鏈。分別制作上游引物(5’-GTATCTGTCATCAAAGAAGGCTG-3’) 和下游引物( 3’-CTACCATCGGTTGTCAGACTT-5’) ,采用PCR檢測(cè)儀進(jìn)行定量擴(kuò)增,并定量檢測(cè)各指標(biāo)。RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?2 ℃ 預(yù)處理5 min; 94 ℃度熱變性10 s; 94 ℃熱處理 5 s,60 ℃延伸35 s,循環(huán)40次; 72 ℃5 min。以β-actin為內(nèi)參,利用定量PCR儀自帶軟件算法2-ΔΔCt獲得各指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量。

    1.2.3 Western blotting檢測(cè):心肌勻漿收集細(xì)胞,RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min,測(cè)定蛋白濃度,按50 μ g/mL蛋白含量配制上樣蛋白樣品。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 (NC膜) 上,5%脫脂牛奶封閉蛋白,依次孵育一抗、二抗,Bradford法進(jìn)行組織勻漿的蛋白定量,以GAPDH為內(nèi)參照,比較ANT蛋白表達(dá)情況。最后用底物發(fā)光法進(jìn)行顯色,膠片曝光。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6.01進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用x-±s表示。組間比較采用t檢驗(yàn)。P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠模型建立

    內(nèi)霉素建模后,模型組、美托洛爾組和艾司洛爾組大鼠均出現(xiàn)精神萎靡不振、豎毛、嗜睡、眼鼻滲血、稀便等膿毒癥癥狀,而對(duì)照組未有上述癥狀。與對(duì)照組比較,模型組、美托洛爾組和艾司洛爾組體溫和和WBC顯著降低 (均P < 0.001) ,而血清TNF-α及IL-6表達(dá)水平都顯著升高 (均P < 0.05) ,表明膿毒癥模型建立成功。見表1。

    2.2 各組大鼠治療前 (0 h) 、治療24、48 h 后心率和平均動(dòng)脈壓比較

    表1 建模后各組體溫、白細(xì)胞、血清TNF-α及IL-6表達(dá)水平比較Tab.1 Body temperature,white blood cell count,and serum TNF-α and IL-6 expression in the four groups after modeling

    結(jié)果顯示,治療前美托洛爾組、艾司洛爾組與模型組比較心率和平均動(dòng)脈壓沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P > 0.05);治療48 h后與模型組比較,美托洛爾組 (P = 0.034) 與艾司洛爾組 (P = 0.027) 心率顯著降低,而美托洛爾組 (P = 0.040) 與艾司洛爾組 (P =0.038) 平均動(dòng)脈壓顯著升高。見表2。

    2.3 各組大鼠治療48 h后心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果

    表2 各組大鼠治療前 (0 h) 、治療24、48 h 后心率和平均動(dòng)脈壓比較Tab.2 Heart rate and mean arterial pressure in the four groups after modeling

    結(jié)果顯示,治療48 h后對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞組織致密,未見明顯血管擴(kuò)張;電鏡下可見肌纖維排列有序,線粒體、肌漿網(wǎng)規(guī)則可見。模型組大鼠心肌細(xì)胞排列疏松,細(xì)胞間可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);電鏡下細(xì)胞肌纖維斷裂,線粒體、肌漿網(wǎng)形態(tài)辨認(rèn)困難。美托洛爾組和艾司洛爾組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)接近對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞,但仍見充血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);電鏡下可見心肌細(xì)胞肌纖維束排列有序,線粒體、肌漿網(wǎng)形態(tài)可見但有部分異常。表明β受體拮抗劑可以一定程度恢復(fù)膿毒癥模型大鼠心肌細(xì)胞線粒體的損傷。見圖1。

    2.4 各組大鼠心肌組織線粒體內(nèi)膜ANT mRNA及蛋白表達(dá)比較

    結(jié)果顯示,治療48 h后,心肌組織線粒體內(nèi)膜ANT的表達(dá)水平與模型組 (0.7±0.3) 比較,美托洛爾組 (1.6±0.6,P = 0.017) 和艾司洛爾組 (1.7±0.7,P = 0.018) ANT mRNA表達(dá)水平顯著增高;Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示,與模型組比較,美托洛爾組和艾司洛爾組ANT蛋白水平也增高 (圖2) 。表明β受體拮抗劑對(duì)治療膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體具有一定保護(hù)作用。

    3 討論

    圖1 各組大鼠治療48 h后心肌HE染色及線粒體觀察Fig.1 Appearance of the mitochondria at 48 h after treatment visualized by HE staining

    圖2 各組心肌組織 ANT蛋白表達(dá)比較Fig.2 Myocardial ANT protein expression in each group

    膿毒癥可以導(dǎo)致明顯的心肌損傷,本研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥模型大鼠心肌細(xì)胞疏松,排列出現(xiàn)紊亂,細(xì)胞間可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),電鏡下可以見到明顯的肌纖維斷裂,線粒體結(jié)構(gòu)受到不同程度的破壞。而美托洛爾組和艾司洛爾組大鼠心肌細(xì)胞排列恢復(fù)有序,電鏡下可見線粒體、肌漿網(wǎng)形態(tài)恢復(fù)接近正常形態(tài)。美托洛爾組和艾司洛爾組心肌組織ANT mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于模型組 (均P <0.05) ,表明β受體拮抗劑對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體的損傷具有一定緩解或者保護(hù)作用。

    革蘭陰性桿菌感染是引起膿毒癥的主要原因,細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)菌壁成分,在敗血癥、多臟器功能衰竭 (multiple organ failure,MOF) 發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。膿毒癥、感染性休克患者的心肌存在Toll樣受體 (Toll-like receptor,TLR) 表達(dá),內(nèi)毒素可引起心肌細(xì)胞產(chǎn)生IL-1 β和TNF-α增加,上調(diào)TLR mRNA水平,并降低心肌的收縮性[14]。相反心肌TLR4表達(dá)缺乏的動(dòng)物則對(duì)內(nèi)毒素反應(yīng)減弱,心肌功能影響減少[15],敲除TLR4基因的大鼠注射內(nèi)毒素后也可觀察到心臟功能障礙弱于野生型[15]。此外TLR4可還可以通過激活MyD88和IFN-β,調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[16],而PI13K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)整心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存,該通路的活化可抑制心肌細(xì)胞凋亡。TLR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致血清TNF-α、IL-1 β濃度增加,并引起心肌線粒體功能障礙。另一方面,TNF-α與心肌細(xì)胞膜特異受體結(jié)合,促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放過多鈣離子,心肌線粒體鈣離子內(nèi)流增加,鈣離子在線粒體內(nèi)積聚、鈣超負(fù)荷,最終可導(dǎo)致線粒體腫脹、破壞,在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到存在相似的過程[17]。TNF-α還可通過啟動(dòng)心肌線粒體凋亡信號(hào),使患者心肌線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔呈高通透狀態(tài),H+內(nèi)流,導(dǎo)致線粒體膜電位缺失,線粒體腫脹、破裂[18]。以上研究表明心肌細(xì)胞線粒體可能在膿毒癥心臟功能損傷中發(fā)揮重要作用,與本研究結(jié)果一致。

    美托洛爾、艾司洛爾是常用的β受體拮抗劑,研究[19]發(fā)現(xiàn)β受體拮抗劑可以促進(jìn)重度膿毒癥患者心率控制、降低死亡率并有效調(diào)節(jié)酸堿常數(shù)。另外一項(xiàng)近期的基于醫(yī)療護(hù)理數(shù)據(jù)的回顧性研究[9]表明β受體拮抗劑可以降低膿毒癥患者31%醫(yī)院死亡率以及41%的30 d死亡率。以上研究說明β受體拮抗劑有利于緩解膿毒癥患者的心臟功能損傷。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用美托洛爾和艾司洛爾可以緩解膿毒癥大鼠的心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)損傷,使ANT的表達(dá)水平增高,表明β受體拮抗劑對(duì)于膿毒癥心肌細(xì)胞線粒體的損傷有保護(hù)作用。這可能的機(jī)制包括:(1) 慢性心力衰竭患者可出現(xiàn)心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶 (SERCA)和Na+/Ca2+泵 (NCX) 表達(dá)異常,可能影響攝取和釋放Ca2+,導(dǎo)致心肌收縮、舒張功能異常,而β受體拮抗劑可以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Ca2+調(diào)整蛋白的表達(dá),從而改善心肌細(xì)胞Ca2+動(dòng)力學(xué),提高心肌細(xì)胞功能[18];針對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞,β受體拮抗劑也有可能通過對(duì)SERCA和NCX的保護(hù)作用來減少線粒體Ca2+超負(fù)荷的發(fā)生,從而達(dá)到保護(hù)線粒體的作用; (2) β受體拮抗劑可以降低膿毒癥心肌線粒體的不飽和脂肪酸指數(shù)以及氧化應(yīng)激,從而影響線粒體功能[20-21]。

    綜上所述,β受體拮抗劑對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷具有一定保護(hù)作用,這將為膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷的預(yù)防和治療提供新的研究方向。本研究不足之處:(1) β受體拮抗劑對(duì)于膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用的分子機(jī)制未進(jìn)一步深入闡明; (2) 本實(shí)驗(yàn)觀察周期較短。因此,以后將進(jìn)一步探索β受體拮抗劑對(duì)于膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體的長(zhǎng)期保護(hù)作用以及具體的分子機(jī)制。

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