玻璃化深低溫法與去細(xì)胞光氧化技術(shù)制備同種異體小動脈體內(nèi)性能比較

黃磊　匡鋒　賴軼權(quán)

【摘要】 目的：通過兔異體頸動脈旁路移植模型，對玻璃化深低溫及去細(xì)胞光氧化交聯(lián)處理的兔頸動脈進(jìn)行體內(nèi)性能比較，評價兩種血管作為臨床異體小血管替代物的可行性。方法：將36只SPF級純種兔隨機(jī)分成兩組，分別予以玻璃化深低溫處理的兔頸動脈及去細(xì)胞光氧化處理的兔頸動脈行異體頸動脈移植。實驗動物分別飼養(yǎng)觀察1周、2周和4周后，觀察移植血管的通暢情況及內(nèi)膜增生情況。結(jié)果：超聲檢查發(fā)現(xiàn)術(shù)后4周去細(xì)胞光氧化組的累計通暢率顯著高于玻璃化深低溫組（P<0.05）。HE染色顯示玻璃化深低溫組術(shù)后免疫反應(yīng)表現(xiàn)比較嚴(yán)重。去細(xì)胞光氧化組術(shù)后內(nèi)皮細(xì)胞則生長良好，炎性細(xì)胞浸潤少。Ⅷ因子染色顯示，術(shù)后4周玻璃化深低溫處理組內(nèi)皮細(xì)胞有不同程度的破壞；而去細(xì)胞結(jié)合光氧化組內(nèi)皮生長良好。通過圖像分析發(fā)現(xiàn)，移植后1周兩組血管內(nèi)/中膜比差異無統(tǒng)計秀而意義（P>0.05），術(shù)后2周及4周內(nèi)膜兩組血管內(nèi)/中膜比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：體內(nèi)性能方面，去細(xì)胞光氧化技術(shù)制備同種異體小動脈生物穩(wěn)定性、抗血栓性及內(nèi)膜增生情況均要優(yōu)于玻璃化深低溫處理的異體兔頸動脈，但同樣也存在瘤樣擴(kuò)張，內(nèi)膜增生等不足。

【關(guān)鍵詞】 去細(xì)胞光氧化； 玻璃化深低溫； 內(nèi)膜增生； 異體小動脈

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.24.001 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805（2018）24-000-04

Comparison of in Vivo Performance of Small-diameterallogenic Arterioles Treated with Decellularization Associated with Photo-oxidation and Cryopreservation/HUANG Lei，KUANG Feng，LAI Yiquan，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（24）：-4

【Abstract】 Objective：To evaluate the feasibility of an alternative source of allogeneic arterioles in coronary artery bypass grafting，we build a model of rabbit allogeneic carotid bypass grafting and compared the in vivo performance of rabbit carotid arteries treated with decellularization associated with photo-oxidation and cryopreservation.Method：A total of 36 SPF purebred rabbits were randomly divided into two groups and separately given carotid bypass surgery with small-diameter allogenic arterioles treated with decellularization associated with photo-oxidation and cryopreservation.The experimental animals were reared for 1 week， 2 weeks and 4 weeks.the hemodynamics and patency of graft vessels were observed through transvascular ultrasound and the intimal hyperplasia of the grafts were observed.Result：Vascular ultrasound examinations revealed that the cumulative patency rate of decellularization associated with photo-oxidation group was significantly higher than that of cryopreservation group（P<0.05）.HE staining showed that the endothelial cells in the cryopreservation group had different degrees of shedding and hyperplasia，thrombosis in the lumen， and the immune response was much more severe.While the endothelial cells grow more well in the decellularization associated with photo-oxidation group with less thrombus formation and less inflammatory cell infiltration at the 4th week after surgery.Ⅷ factor staining showed that endothelial cells were disrupted and disorganized in the cryopreservation group while endothelial growth was much better in the ecellularization associated with photo-oxidation group 4 weeks after surgery.The image analysis system showed that there was no significant difference in intima/media ratio after the first week of bypass surgery （P>0.05），but significant difference began to occur between the two groups at 2 and 4 weeks postoperatively （P<0.05）.Conclusion：In terms of in vivo performances，the biological stability，antithromboticity，and intimal hyperplasia of rabbit allograft in the decellularization associated with photo-oxidation group were all superior to those of cryopreservation group，but there are also tumor-like expansion，intimal hyperplasia and other deficiencies existing for us to modify.

【Key words】 Decellularization associated with photo-oxidation； Cryopreservation； Intimal hyperplasia； Allogeneic arteriole

First-authors address：Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen 518000，China

包括冠心?。–HD）和外周動脈疾病（PAD）在內(nèi)的閉塞性動脈疾病，是導(dǎo)致人類意外死亡的主要原因之一，預(yù)計至2030年該類疾病導(dǎo)致的全球死亡率將上升為2330萬[1]。對于閉塞性動脈疾病，目前的血運(yùn)重建技術(shù)主要包括血管成形、支架植入和手術(shù)搭橋三種。而手術(shù)搭橋的橋血管來源方面，自體血管仍是小口徑血管的“金標(biāo)準(zhǔn)”移植物[2]，目前臨床上比較常用的有大隱靜脈、胸廓內(nèi)動脈、橈動脈等。然而獲取這一類血管往往需要進(jìn)行額外的手術(shù)操作，并且所截取的血管往往無法達(dá)到臨床使用的要求。人工合成的血管移植物是自體血管的有效替代物，目前該類人工血管已經(jīng)廣泛用于大、中等直徑的動脈（如頸動脈或股總動脈）的手術(shù)操作，雖取得了令人滿意的長期結(jié)果，但當(dāng)應(yīng)用于小直徑血管時，如冠狀動脈和膝關(guān)節(jié)以下的動脈時，遠(yuǎn)期通暢率遠(yuǎn)不能達(dá)到臨床要求[3]。考慮到目前的血管旁路管道的局限性，具有生長、重塑和體內(nèi)修復(fù)能力的異體來源的小血管，為血管手術(shù)的未來提供了一種潛在的解決方案。本實驗通過研究比較玻璃化深低溫法、去細(xì)胞光氧化法這兩種技術(shù)處理后的異體小血管，對比兩者在組織結(jié)構(gòu)及抗原性方面的變化，以期為同種異體小血管移植的臨床應(yīng)用提供一種新的思路。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及材料

1.1.1 實驗動物及分組 36只SPF級純種兔，雌雄不限，年齡6～12個月，體重1.5～2.5 kg。由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字法，將動物隨機(jī)分成2組，玻璃化深低溫處理組（n=18）及去細(xì)胞光氧化組（n=18）；分別采用玻璃化深低溫處理的異體兔頸動脈及去細(xì)胞光氧化處理的異體兔頸動脈行移植搭橋。

1.1.2 血管預(yù)處理 去細(xì)胞光氧化處理兔頸動脈：依據(jù)前期實驗中所取得的最佳去細(xì)胞過氧化方案及玻璃化深低溫保存方案[4]，玻璃化深低溫處理的兔頸動脈置于液氮中保存，2周后40℃水浴復(fù)溫，平衡液洗脫后備用。經(jīng)去細(xì)胞處理的兔頸動脈置無菌PBS液中，充分沖洗脫色后備用。

1.2 方法

實驗用兔術(shù)前禁食4 h，肝素200 U/kg經(jīng)耳緣靜脈注射，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，仰臥位固定于手術(shù)臺，刮凈術(shù)區(qū)皮膚，絡(luò)合碘消毒，鋪蓋無菌巾。頸部正中切開皮膚，游離皮下及各肌層，沿氣管分離右側(cè)頸總動脈，遠(yuǎn)、近心端各置血管夾，兩夾之間相距1.5 cm左右，切除其間動脈。取相應(yīng)各組移植血管，裁剪成相應(yīng)長度，予9-0無創(chuàng)縫線行連續(xù)端端縫合，手術(shù)完畢后逐層縫合各組織。動物蘇醒后常規(guī)肌注青霉素20萬單位/只（1次/d）共3 d，飼料用混合飼料，術(shù)后密切觀察。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 多普勒血管彩超檢查 分別于術(shù)后1、2及4周采用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg行腹腔注射麻醉實驗兔。經(jīng)HPsonos4500型超聲成像探頭（頻率10 MHz）檢測移植血管通暢情況。如管腔內(nèi)無實性低回聲區(qū)，透聲好，血流頻譜呈動脈頻譜，提示移植血管管腔通常；而局部出現(xiàn)實性回聲區(qū)提示移植血管內(nèi)血栓形成，血流信號消失提示移植血管閉塞。明確實驗兔頸動脈移植血管通暢程度后，于耳緣靜脈內(nèi)注射肝素抗凝（3 mg/kg），經(jīng)原切口取出移植兔頸動脈，沿長軸縱行剪開移植血管，肉眼觀察大體形態(tài)；然后剪取部分血管組織，置入10%福爾馬林內(nèi)保存。分別進(jìn)行下述指標(biāo)的對比檢測。

1.3.2 大體觀 各組標(biāo)本取出后，觀察管腔有無血栓、管壁有無明顯增厚，變性，血管的大體形態(tài)（柔軟度、與周圍組織的粘連程度、鈣化等）。

1.3.3 光鏡觀察 每組取一小塊血管片，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅染色及彈力纖維染色后行光鏡觀察。

1.3.4 Ⅷ因子染色 通過Ⅷ因子染色檢測兔頸動脈血管腔面是否有內(nèi)皮細(xì)胞生長，標(biāo)本常規(guī)脫蠟和水化后按試劑盒介紹的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行第一、二抗體染色后置顯微鏡下觀察。

1.3.5 圖像分析系統(tǒng)觀察 參照J(rèn)acobs等[5]對胞核陽性標(biāo)本的判定方法，從每張染色片上隨機(jī)選取5～7個視野，VIDAS圖像分析系統(tǒng)（德國歐波同公司）光鏡下按統(tǒng)一放大倍數(shù)（10×40倍）進(jìn)行分析。在彈力纖維染色結(jié)果中計算內(nèi)膜中膜厚度比代表增殖情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有統(tǒng)計由統(tǒng)計軟件SPSS 13.0完成，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)及動物存活情況

術(shù)中及術(shù)后均無實驗動物死亡，所有存活動物無偏癱、頭頸歪曲，頸動脈搏動良好；兩組術(shù)后均有移植血管出現(xiàn)不同程度瘤樣擴(kuò)張的現(xiàn)象，玻璃化深低溫組3例，去細(xì)胞光氧化組1例。術(shù)后1周，2周及4周沿原切口顯露雙側(cè)頸動脈未完全堵塞的移植血管可見搏動。去細(xì)胞光氧化組無閉塞、破裂情況，于遠(yuǎn)端吻合口處切斷血管可見血液噴出，玻璃化深低溫組術(shù)后4周兩根移植血管于遠(yuǎn)端吻合口處切斷后無血液噴出，提示完全堵塞。

2.2 超聲檢查

分別于術(shù)后1周，2周及第4周隨機(jī)抽取6只實驗動物行移植段血管超聲檢測，見圖1A，統(tǒng)計術(shù)后4周累計通暢率。檢測標(biāo)準(zhǔn)：血管管腔內(nèi)局部發(fā)現(xiàn)實性低回聲區(qū)，提示局部有血栓形成，管腔內(nèi)血流信號消失提示血管閉塞，見圖1B。結(jié)果顯示：去細(xì)胞光氧化組移植血管術(shù)后4周內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)血管閉塞，玻璃化深低溫組2根血管在第4周時出現(xiàn)信號消失現(xiàn)象，提示血管完全閉塞。但兩組血管中不同時段均可在血管管腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)局部的實性低回聲區(qū)，提示局部有血栓形成，見圖1B。術(shù)后1周血栓形成情況玻璃化深低溫組和去細(xì)胞光氧化組分別為1/6、1/6，術(shù)后2周兩組血栓形成情況分別為3/6、1/6，術(shù)后4周血栓形成情況分別為6/6、3/6，見表1。根據(jù)“確切概率法”用行×列表行字2檢驗，術(shù)后4周去細(xì)胞光氧化組累計通暢率高于玻璃化深低溫組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 各組大體觀察及HE染色光鏡觀察

所有移植血管樣本的大體觀察及HE染色顯示，玻璃化深低溫組術(shù)后1周移植血管搏動良好，顏色與自體血管一致，吻合口輕度粘連，HE染色顯示血管內(nèi)壁欠光滑；免疫反應(yīng)表現(xiàn)比較嚴(yán)重，中層及外膜可見淋巴細(xì)胞浸潤，第2周時，血管搏動可，顏色與自體血管基本一致，管壁變厚，管腔變窄；HE染色可見外膜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，部分血管管腔內(nèi)可見血栓形成。第4周時移植血管搏動不良，顏色變淺，較自體血管蒼白，移植段血管增生肥厚。管腔狹窄或堵塞，中層彈力纖維排列不連續(xù)，松散，部分管腔幾乎完全被血栓填充，見圖2A。去細(xì)胞光氧化組術(shù)后1周移植血管搏動良好，顏色與自體血管一致，與周圍組織無明顯粘連，血管內(nèi)壁光滑；同時血管內(nèi)壁見散在內(nèi)皮細(xì)胞生長，外膜見少許淋巴細(xì)胞浸潤。第2周時，移植血管搏動良好，顏色與自體血管一致，與周圍組織輕度粘連，血管內(nèi)壁光滑，可見明顯內(nèi)皮細(xì)胞長入，血管管壁未見明顯破壞及變性改變，管壁彈性纖維連續(xù)致密，外膜淋巴細(xì)胞浸潤少。第4周時移植血管形態(tài)仍保持紅潤，與自體血管無明顯差異，HE染色顯示基本形成類似于正常血管壁的結(jié)構(gòu)，管壁內(nèi)彈性膜完整，彈性纖維連續(xù)性好，見圖2B。

2.4 Ⅷ因子染色

去細(xì)胞結(jié)合光氧化組Ⅷ因子染色陽性，有內(nèi)皮樣細(xì)胞生長，見圖3A箭頭所示。而玻璃化深低溫處理組Ⅷ因子染色提示內(nèi)皮細(xì)胞有不同程度的破壞甚至未見內(nèi)皮細(xì)胞，見圖3B。

2.5 增生程度圖象分析

觀察彈力纖維染色玻片，使用圖像分析系統(tǒng)計算內(nèi)膜/中膜厚度比（I∶M）代表內(nèi)膜增殖程度。通過比較可見，兩組血管移植后1周I∶M比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后2周，兩組移植血管的I∶M比值均有所升高，玻璃化深低溫組為（0.28±0.12），去細(xì)胞光氧化組為（0.23±0.11），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后4周，玻璃化深低溫組I：M比值為（0.45±0.15），要顯著高于去細(xì)胞光氧化組的（0.31±0.12），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。玻璃化深低溫組術(shù)后4周I∶M比值較術(shù)后2周有顯著上升，而去細(xì)胞光氧化組移植血管的I∶M比值則上升的相對平穩(wěn)。

3 討論

隨著外周血管手術(shù)技巧的逐步成熟，小口徑（<6 mm）血管移植物的需求增長迅速。但由于術(shù)后早期急性血栓的形成、內(nèi)皮化的不完全及和遠(yuǎn)期植入后的內(nèi)膜增生，這些因素往往導(dǎo)致異體小血管的術(shù)后通暢率無法滿足臨床要求[6-7]。盡管植入后血栓事件是小口徑人工血管長期低通暢率的主要限制因素，但迄今為止，去細(xì)胞化的天然組織仍是臨床最廣泛的使用方法[8]。脫細(xì)胞處理存在一定的爭議，因為該過程的不完整可能導(dǎo)受體發(fā)生免疫原性反應(yīng)，而過度的脫細(xì)胞處理又會導(dǎo)致移植橋血管機(jī)械性能的喪失及遠(yuǎn)期動脈瘤發(fā)生的可能[9-10]。筆者將脫細(xì)胞后的兔頸動脈通過光氧化交聯(lián)固定，以期達(dá)到增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度的目的，通過此次動物實驗4周的觀察，光氧化組術(shù)后無橋血管瘤樣擴(kuò)張的情況發(fā)生。而相比較之下，18例玻璃化深低溫移植組的兔頸動脈中有3例移植血管發(fā)生了瘤樣擴(kuò)張，前期實驗中我們曾證實去細(xì)胞過氧化處理的兔頸動脈熱皺縮溫度、抗張強(qiáng)度及最大拉伸距離要優(yōu)于玻璃化深低溫處理的兔頸動脈[4]，從此次實驗中瘤樣擴(kuò)張的發(fā)生概率來看，也側(cè)面證實了玻璃化深低溫處理對異體小血管機(jī)械性能存在一定程度的影響。

低溫保存技術(shù)是存儲同種異體大血管移植物的有價值的技術(shù)[11-12]。但低溫保存方法對移植物抗原性的影響一直存在爭論，主要分歧在于該處理方式對同種異體移植物抗原性的影響，對此不少學(xué)者進(jìn)行了多方面驗證[13-15]。通過本次實驗的HE染色觀察，玻璃化深低溫處理的異體小血管在移植后早期淋巴細(xì)胞浸潤程度要明顯于去細(xì)胞光氧化處理的異體小動脈，后期血管重構(gòu)程度也明顯不如去細(xì)胞光氧化組的異體小血管，血栓形成率更高（累及通暢率44.4% vs 72.2%）。提示玻璃化深低溫保存方法仍保存了血管組織的部分抗原性，從而引起宿主動物的免疫排斥反應(yīng)。而去細(xì)胞光氧化反應(yīng)組的移植血管因為血管前期處理時去除了最主要的抗原性內(nèi)皮細(xì)胞，所以術(shù)后移植血管結(jié)構(gòu)基本正常，管壁炎性細(xì)胞浸潤程度明顯減輕，術(shù)后4周對該組血管行Ⅷ因子染色檢測，均觀察到內(nèi)皮細(xì)胞生長良好且均勻分布，彈力纖維連續(xù)，并且在有些管道外壁還可見較多新生血管的形成，提示該組移植血管兼容程度較好。前期實驗證實，去細(xì)胞光氧化是一個無細(xì)胞毒性的化學(xué)試劑參與過程，同時又保留了較完整的、無免疫排斥的血管基質(zhì)[4]，因此內(nèi)皮細(xì)胞更易于粘附生長，隨著移植血管內(nèi)皮化程度逐步完全，血栓形成率大幅下降。

術(shù)后內(nèi)膜增生也是玻璃化深低溫組異體小動脈的一個突出問題。通過比較術(shù)后兩組的I∶M比值發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1周兩組移植血管的I∶M比無明顯差異，而術(shù)后2周兩組均有所上升，且上升程度有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），術(shù)后4周玻璃化深低溫組兔頸動脈I∶M比值上升程度較為顯著，而去細(xì)胞光氧化組的I∶M比值則相對平穩(wěn)，提示去細(xì)胞光氧化組的近期效果優(yōu)于玻璃化深低溫組。進(jìn)一步比較兩組I∶M比值上升速率，提示去細(xì)胞光氧化組遠(yuǎn)期通暢率亦優(yōu)于玻璃化深低溫組。當(dāng)然也有不足，因為從I∶M比值整體上升趨勢來看，去細(xì)胞光氧化組移植血管同樣也存在內(nèi)膜增生的趨勢。

本次實驗證實，去細(xì)胞結(jié)合光氧化處理的異體兔頸動脈體內(nèi)穩(wěn)定性優(yōu)于玻璃化深低溫保存的異體兔頸動脈，移植后具有更高的遠(yuǎn)期通暢率。但同樣也存在瘤樣擴(kuò)張，內(nèi)膜增生等不足，提示我們在后續(xù)的實驗中需要采取相應(yīng)的針對性措施以改進(jìn)。

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（收稿日期：2018-07-09）