雌激素抑制受體型酪氨酸磷酸酯酶O促進小鼠腎足細胞增殖

任 瑋，王 湘，包 瑛，高新茹

西安市兒童醫(yī)院1門診內科，3腎內科；2西安醫(yī)學院病理生理教研室，陜西 西安 710003；4西北婦女兒童醫(yī)院超聲中心，陜西 西安 710061

腎足細胞在腎小球濾過中起至關重要的作用，是組成濾過屏障的主要成分[1]。在對奧爾波特綜合征病人的研究中顯示，足細胞數(shù)量和密度的減少會誘發(fā)蛋白尿，腎小球硬化癥，腎功能減低等疾病[2]。雌激素影響腎臟疾病的多種生理病理功能，包括對血流動力學、系膜細胞、系膜基質、膠原代謝、細胞因子、炎癥介質的釋放以及腎小球濾過等多方面調節(jié)。楊霽云等研究表明，微小病變是腎病病理的常見類型，兒童發(fā)病率達到76%[3]。電鏡下足細胞的足突融合是微小病變的臨床特點，也是小兒腎病最常見的病理變化，發(fā)病高峰為3～4歲[3]。病重時，足細胞與腎小球基底膜分離、脫落、凋亡。因此，探討腎足細胞凋亡的機制有助于小兒腎病綜合征病理研究。但目前關于足細胞凋亡機制的研究還有不足，對腎足細胞的增殖機制還知之甚少。現(xiàn)有研究表明，雌激素可通過雌激素相關受體γ抑制腎小球足細胞的凋亡[4]。而本文主要研究雌激素對腎足細胞增殖的影響，并探討其可能的影響機制，希望對小兒腎病綜合征的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

小鼠腎足細胞系MPC5（上海酶研生物科技有限公司，貨號：56687）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen）；pcDNA3.1（+）空載體（美國 Invitrogen）；小 鼠 anti-JAK1、anti-JAK2、anti-p-JAK2（Y1007）、anti-STAT3以及anti-p-STAT3（Y705）抗體（美國Abcam）；RNA提取試劑盒（美國Sigma-Aldrich，貨號：RNB100-50RXN）；反轉錄試劑盒（MMLV）（美國Invitrogen）；PCR試劑盒（日本Takara）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）；MTT試劑盒（中國碧云天）。

1.2 細胞培養(yǎng)

將MPC5細胞系置于含有10%牛胎兒血清的DMEM 培養(yǎng)基中，充分吹打后移入96孔板中，保持細胞密度為1×105/mL，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h換液1次，72 h后用于實驗。

1.3 過表達載體的轉染

構建酪氨酸磷酸酯酶O（PTPRO）過表達載體時，將來自正常小鼠cDNA的PTPRO片段在BamHI和EcoRI位點之間克隆至購買的pcDNA3.1（+）空白載體中，以E. coli DH5α細胞進行PTPRO的豐度表達。PTPRO引物如下：上游引物5’-gga ACC ACT GAC CTG TCC CAC TC-3’，下游引物5’-ctc GGT GTT GCT CCC TCT CTC AG-3’。采用限制性酶切和DNA測序鑒定PTPRO重組質粒。隨后，通過Lipofectamine 2000介導將pcDNA3.1（+）/PTPRO和pcDNA3.1（+）質粒分別轉染入MPC5細胞中，western blot 和 RT-PCR檢測轉染效果。ERα和ERβ過表達載體的構建同上。

1.4 Western blot

用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進行總蛋白的定量。將定量后的總蛋白用10%SDS-PAGE分離，NC膜進行轉膜，3%（v/v）BSA封閉45 min，孵育一抗anti-JAK1（1：1000）、anti-JAK2（1：5000）、anti-p-JAK2（Y1007）（1：1000）、anti-STAT3（1：1000）以及anti-p-STAT3（Y705）（1：2000）抗體4 ℃過夜或者37 ℃ 4 h，TBST洗3 min/次×3，孵育山羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗（1：10000）1 h，TBST洗3 min/次×3，ECL發(fā)光。β-actin作為內參。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)及Quantity One4.62進行條帶的記錄及定量。

1.5 RT-PCR

采用RNA提取試劑盒提取總RNA，取3 μL總RNA測濃度以及純度。反轉錄試劑盒（M-MLV）進行cDNA第一條鏈的合成，PCR試劑盒進行PTPRO 目的基因擴增。選用β-actin基因為內參。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)及Quantity One4.62進行條帶的記錄及定量。引物采用Primer6.0軟件設計并由Invitrogen合成。PTPRO（mouse）NCBI序列號：NM_001164401，上游引物（5'-3'）acc act gac ctg tcc cac tc，下游引物（5'-3'）agg tgt tgc tcc ctc tct ca，產物長度172 bp，退火溫度60.0 ℃。

1.6 細胞增殖檢測

按照MTT細胞增殖檢測試劑盒的說明書進行細胞增殖的檢測，將細胞配制成單細胞懸液，以每孔1×104細胞接種于96孔板上，嚴格按照MTT試劑盒說明書進行操作，讀取各孔的A570nm值，空白孔（只加培養(yǎng)液）調零，每組重復3次，結果取均值。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，兩組比較行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雌激素對小鼠腎足細胞中PTPRO的表達的影響

PTPRO的表達隨17β-Estradiol（E2）劑量的增加而減少，而隨E2拮抗劑tamoxifen劑量的增加而增加（P＜0.05，圖1）。

圖1 17β-Estradiol（E2）以及其拮抗劑tamoxifen對PTPRO的表達的影響

2.2 雌激素結合不同受體對小鼠腎足細胞中PTPRO表達的影響

圖2A表示鑒定ERα和ERβ過表達載體的轉染效果。當E2結合ERα時，可抑制小鼠腎足細胞中PTPRO表達（P=0.0470）；而當E2結合ERβ時，可徹底阻止小鼠腎足細胞中PTPRO表達（P=0.0232，圖2）。

2.3 PTPRO對JAK/STAT信號通路的影響

PTPRO對JAK1蛋白表達沒有影響（P＞0.05），可提高JAK2、p-JAK2（Y1007）、STAT3以及p-STAT3（Y705）蛋白的表達（P＜0.05，圖3）。

2.4 雌激素通過抑制PTPRO表達的促進腎小球足細胞增殖

E2可抑制腎小球足細胞的生長抑制率（P＜0.05），促進其增殖。而PTPRO過表達可提高E2誘導的腎小球足細胞的生長抑制率的降低（P＜0.05，圖4）。

圖2 雌激素結合不同受體對PTPRO表達的影響

圖3 PTPRO對JAK/STAT信號通路的影響

3 討論

小兒腎病綜合癥由多種病因導致腎小球基底膜通透性增加，從而大量蛋白從尿中丟失[5-6]。足細胞附著于腎小球基底膜外側，與血管內皮細胞和腎小球基膜一起構成腎小球血液濾過屏障[7-9]。因此，足細胞凋亡會增加腎小球基底膜通透性，誘發(fā)蛋白尿，是小兒腎病綜合征的發(fā)病因素之一[8，10-11]，而足細胞增殖則可抵御小兒腎病綜合征的發(fā)生。

圖4 雌激素通過抑制PTPRO表達的阻止腎小球足細胞增殖

對大鼠腎包裹性高血壓模型研究發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠去勢可減輕蛋白尿、腎小球和腎小管的損傷程度，而加用雙氫睪酮則抑制該保護作用；雌性大鼠去勢可加重腎小球和腎小管的損傷程度，加用17β-雌二醇則可減輕去勢加重的腎臟損傷，而加用雙氫睪酮則抑制該保護作用[12]。故雄激素對腎包裹性高血壓誘導的腎損傷有加重作用，而雌激素對其有保護作用。與本研究相符，雌激素可促進腎小球足細胞增殖，保護腎損傷。Fung等[13]對1044例絕經后女性進行了10年的橫斷面觀察，發(fā)現(xiàn)使用雌激素替代治療組婦女血壓明顯低于不使用雌激素替代治療組婦女，前者腎小球濾過率明顯高于后者；10年后，前者血壓明顯下降，尿白蛋白/肌酐比值明顯下降，而腎小球濾過率無明顯變化。說明絕經后雌激素替代治療有利于血壓、腎小球濾過率和尿白蛋白/肌酐等反映慢性腎臟疾病進展指標。因此，本研究表明，雌激素對腎小球足細胞的增殖作用，可進一步降低腎小球基底膜通透性，降低蛋白尿，預防腎病綜合癥及小兒腎病綜合征的發(fā)生。

PTPRO有6種轉錄變體，全長 PTPRO 在腎和腦中表達最高，在其他組織包括肝臟、乳腺等也有較高的表達[14]；研究發(fā)現(xiàn)，PTPRO在原發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化、嚴重IgA腎病以及實驗性足細胞損傷導致足突過程消失等多種蛋白尿性腎病中不表達[15-17]。在分離的大鼠和兔腎小球中，采用特異性抗體封閉PTPRO可提高白蛋白的滲透性，進一步說明PTPRO在維持腎小球選擇通透性中起至關重要的作用[18]。在女性子癇前期的腎損傷中，足細胞脫落，PTPRO的表達降低[19]。研究表明，雌激素-雌激素受體復合物（E2-ER）可以調節(jié)PTPRO的轉錄，并且ERα與ERβ在調節(jié)過程中扮演著相反的角色。與本研究結果一致，在小鼠腎足細胞中，PTPRO的表達隨E2劑量的增加而減少，也即E2可抑制PTPRO的表達。盡管 ERα可促進PTPRO的轉錄活化，然而居于主導地位的是ERβ對PTPRO的轉錄抑制：結合了17βestradiol（E2）的ERβ通過作用于PTPRO啟動子區(qū)域的AP-1位點，使c-jun和c-fos基因與PTPRO啟動區(qū)的AP-1發(fā)生分離，從而抑制了PTPRO的轉錄[20]。本研究也證實了這一點，當E2結合ERα時，可抑制小鼠腎足細胞中PTPRO表達。而當E2結合ERβ時，可徹底阻止小鼠腎足細胞中PTPRO表達。表明E2與ERβ結合抑制PTPRO表達可能居于主導地位。

PTPRO可調控JAK/STAT通路的信號轉導。研究表明，PTPRO基因調控JAK2的酪氨酸磷酸化過程，最終調節(jié)STAT3信號的活化。而在加入了JAK2特異性抑制劑AG490的人肝細胞肝癌細胞系中，PTPRO基因的過表達作用并沒有發(fā)現(xiàn)調控了STAT3的特異性磷酸化位點Y705的磷酸化作用。該現(xiàn)象表明PTPRO介導的STAT3的Y705位點的磷酸化作用依賴于JAK2的激活[21]。本研究更加深入的直接采用腎足細胞探討PTPRO對JAK/STAT通路的調控作用，結果表明PTPRO的過表達可提高JAK2的表達并激活JAK2，且增加STAT3的表達并激活STAT3。因此，PTPRO可激活JAK/STAT信號通路。此機制可能與雌激素促進小鼠腎足細胞增殖有關。

綜上所述，雌激素可通過結合其受體ERα或者ERβ抑制小鼠腎足細胞PTPRO表達，使JAK/STAT信號通路失活，促進腎小球足細胞增殖，預防小兒腎病綜合癥。希望本研究可為小兒腎病綜合癥的預防提供新思路。