維替泊芬抑制腎癌細胞769-P增殖及其機制

劉國欽，胡國強，冼玉榮，曾貴林，李姝君

1江門市新會區(qū)人民醫(yī)院腎內(nèi)內(nèi)分泌科，廣東 江門 529100；2江門市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 江門 529100；3廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤一區(qū)，廣東 湛江 524000

腎細胞癌（腎癌），男性患者多于女性患者，屬于泌尿生殖系統(tǒng)中的高發(fā)惡性腫瘤[1-2]。近年來，伴隨著環(huán)境因素的變化以及國民生活方式的改變，腎癌的發(fā)病率逐年上升[3-4]。目前針對腎癌的治療方案主要為手術(shù)切除療法，但是切除術(shù)后出現(xiàn)腎癌復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移仍然為治療的一大難題?；?、放療為惡性腫瘤的重要治療方案，結(jié)合外科手術(shù)切除治療取得良好的療效。由于腎癌細胞中常常表達多藥耐藥基因（MRD），編碼多藥耐藥蛋白并錨定于細胞膜表面，具有藥物泵的作用，可加速將進入腎癌細胞中的藥物泵出細胞外而使化療藥物失去療效[5-7]。相對于其它惡性腫瘤而言，腎細胞癌對化療和放療敏感性弱，預(yù)后不良[8-9]。維替泊芬于2000年獲得批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療的一種光學(xué)增強劑，主要治療以脈絡(luò)膜血管形成為主的老年黃斑相關(guān)疾病。近年來，多篇文獻報道維替泊芬具有抑制多種腫瘤細胞生存的能力，包括肝癌、甲狀腺癌及血液系統(tǒng)惡性疾病等[10-17]。維替泊芬通過調(diào)控相關(guān)細胞通路及基因的表達，作用于癌細胞的基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯水平，促進腫瘤細胞凋亡并抑制其生長。截至目前為止，未見研究報道關(guān)于維替泊芬對腎細胞癌的作用。本文通過探究維替泊芬對腎細胞癌的殺傷作用，進一步研究該藥物殺傷腎細胞癌的潛在機制，為開發(fā)腎癌治療新藥物及新治療靶點奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

769-P細胞來源于ATCC。維替泊芬（Verteporfin，純度≥98%）購自Selleckchem。RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液、0.25%胰酶、胎牛血清均購自BI。細胞增殖檢測試劑盒（CCK8）購自Dojindo。免疫印跡實驗的所有抗體均購自CST。熒光定量PCR及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Takara。實時熒光定量PCR引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司提供合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 769-P細胞以普通完全培養(yǎng)基（含10% FBS的1640）于孵箱中培養(yǎng)。細胞增殖至培養(yǎng)皿的75%～85%時，消化并傳代培養(yǎng)。

1.2.2 維替泊芬藥物溶液配制 維替泊芬用二甲基亞砜充分溶解，配成濃度為100 μmol/L的母液，保存于超低溫冰箱中。實驗前用PBS緩沖液將維替泊芬母液配成不同濃度的工作液備用。

1.2.3 維替泊芬半數(shù)抑制濃度測定 取狀態(tài)良好的769-P細胞以5000/孔接種于96孔板中，24 h后按照實驗需求將培養(yǎng)基更換為含維替泊芬的培養(yǎng)液，濃度分別為0、0.1、0.5、1、5、10、20 μmol/L，每個濃度4復(fù)孔。完全培養(yǎng)基組為空白組，0 μmol/L組為對照組。加藥處理48 h后按照CCK8說明書指示進行操作，利用全波長酶標(biāo)儀檢測A450nm。抑制率=100%-（實驗組-空白組）/（對照組-空白組）×100%。

1.2.4 細胞增殖實驗 769-P細胞以2000/孔接種于96孔板中，24 h后按照實驗設(shè)計將培養(yǎng)基更換為含維替泊芬的培養(yǎng)液。利用CCK8分別檢測加藥后第0、24、48、72 h的細胞活性，計算并繪制生長曲線。

1.2.5 細胞凋亡及周期實驗 769-P細胞以5×105/孔接種于6孔板中，24 h后按照實驗設(shè)計將培養(yǎng)基更換為含維替泊芬的培養(yǎng)液，藥物濃度依次為0、1、5、10 μmol/L，細胞于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用按照APC/PI凋亡試劑盒和BD公司的周期試劑盒說明書指示進行細胞處理，流式細胞儀進行后續(xù)細胞凋亡和細胞周期的檢測。

1.2.6 劃痕實驗 狀態(tài)良好的769-P細胞以1×106/孔的密度接種于6孔板中，待細胞增殖至密度達90%～100%時，用無菌的中槍頭在細胞中迅速劃痕，更換相應(yīng)藥物濃度的培養(yǎng)基，加藥濃度依次為0、1、5、10 μmol/L加藥前于倒置顯微鏡下拍照，培養(yǎng)48 h后再拍照1次。

1.2.7 克隆實驗 腎癌769-P細胞以1000/孔的密度接種于6孔板中，24 h后按照實驗設(shè)計將培養(yǎng)基更換為含維替泊芬的培養(yǎng)液，藥物濃度分別為0、1、5、10 μmol/L，細胞培養(yǎng)10 d后用PBS緩沖液沖洗干凈，固定液固定0.5 h，繼續(xù)沖洗后加入結(jié)晶紫染色0.5 h，沖洗干凈染色液后拍照。細胞克隆為超過50個細胞的細胞團。

1.2.8 實時熒光定量PCR 用TRIzol裂解細胞并提取總RNA。嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR說明書（TaKaRa）指示進行細胞總RNA的逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量檢測。實時熒光定量PCR引物序列見表1。內(nèi)參基因選用GAPDH，利用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.9 Western blotting 收集各組細胞并洗滌干凈，加入適量的強效細胞裂解液并充分吹打混勻，放置于冰上裂解0.5 h。低溫離心機中12 000 r/min離心12 min后收集上清液。BCA蛋白定量法檢測各實驗組細胞裂解液中的蛋白濃度，加入適量的蛋白上樣緩沖液并充分混勻，100 ℃雙蒸水中煮 8min后將樣品保存于超低溫冰箱中。SDS-PAGE電泳：預(yù)先制備好SDSPAGE凝膠，每個電泳通道的上樣蛋白量為35 μg，恒壓80 V電泳20 min后切換到110 V電泳約70 min；利用250 mA恒流濕轉(zhuǎn)法將SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到標(biāo)記好的PVDF膜上；5%BSA溶液封閉約70 min后孵育相應(yīng)一抗溶液，低溫搖床上搖晃孵育一抗過夜；TBST洗滌一抗5次，總共0.5 h；室溫下孵育二抗約70 min；TBST洗脫二抗4次，總共2 0min；加入預(yù)先配制的ECL發(fā)光液并放置于Tannon成像系統(tǒng)中，顯色，拍照。

1.2.10 統(tǒng)計學(xué)方法 計數(shù)資料及計量資料均采用雙側(cè)檢驗，參數(shù)檢驗采用t檢驗而非參數(shù)檢驗采用χ2檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism 7軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 維替泊芬對腎癌細胞769-P形態(tài)及生長的影響

維替泊芬對769-P細胞的半數(shù)抑制濃度為4.917 μmol/L。2 μmol/L的維替泊芬作用于769-P細胞24 h后即能改變細胞形態(tài)，抑制細胞生長。

2.2 維替泊芬抑制769-P細胞增殖

CCK8實驗結(jié)果顯示，隨著維替泊芬濃度的升高以及作用時間的延長，細胞增殖速率變慢，說明維替泊芬抑制腎癌769-P細胞增殖具有濃度依賴性和時間依賴性（P＜0.05，圖1A-B）。

2.3 維替泊芬促進腎癌769-P細胞凋亡并阻滯769-P細胞生長周期

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示隨著維替泊芬濃度的增大，769-P細胞凋亡率越高。各濃度維替泊芬處理后769-P細胞G0/G1期比例增加，S期及G2/M期比例均比對照組細胞少（P＜0.05，圖1C-D）。

2.4 維替泊芬抑制769-P細胞遷移

細胞劃痕實驗顯示，隨著維替泊芬濃度的增大，細胞遷移距離變小，說明維替泊芬抑制腎癌細胞遷移的能力（P＜0.05，圖2A-H）。

圖1 維替泊芬對769-P細胞增殖、凋亡及周期的影響

圖2 細胞劃痕實驗

2.5 克隆實驗

空白對照組明顯可見細胞克隆形成，1 μmol/L維替泊芬處理組細胞克隆形成數(shù)目略少于正常對照組，5 μmol/L維替泊芬處理組細胞克隆較少，10 μmol/L維替泊芬處理組基本未見細胞克隆形成（P＜0.05，圖3）。

圖3 不同濃度維替泊芬對對769-P細胞克隆形成能力的影響

2.6 實時熒光定量PCR

維替泊芬作用于腎癌769-P細胞后降低Bcl-2基因、YAP基因、TEAD基因及CyclinD1基因表達量，Bax基因、CDK4基因及Caspase-3基因的表達量上升（P＜0.05，圖4A）。

2.7 Western blotting

維替泊芬作用于腎癌769-P細胞后降低Bcl-2蛋白、YAP蛋白、TEAD蛋白及CyclinD1蛋白表達量，Bax蛋白、CDK4蛋白及Caspase-3蛋白的表達量增加（P＜0.05，圖4B）。

圖4 維替泊芬對相關(guān)基因及蛋白表達的影響

3 討論

目前，腎細胞癌的發(fā)生率逐年升提高，其發(fā)病率在泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中排行第2位，僅次于膀胱癌，并且部分病人在初診時已經(jīng)出現(xiàn)癌細胞轉(zhuǎn)移。目前腎癌的主要治療方法為外科治療，由于腎癌對放療和化療敏感性弱，促使科研工作者們致力于研究并探尋新的治療腎癌藥物[1-2]。維替泊芬是一種用于治療老年黃斑相關(guān)疾病的光學(xué)增強劑，近年來多項研究發(fā)現(xiàn)維替泊芬可調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因及細胞信號通路從而抑制多種癌細胞增殖，具有治療肝癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌及白血病等多種惡性腫瘤[10-17]。

本研究發(fā)現(xiàn)維替泊芬具有抑制腎癌769-P細胞增殖能力，并且抑制效率呈濃度依賴性。維替泊芬具有抑制腎癌細胞遷移及侵襲的能力。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)加大維替泊芬濃度，腎癌769-P細胞凋亡率呈濃度依賴性上升。熒光定量PCR及免疫印跡實驗結(jié)果顯示，維替泊芬作用于腎癌769-P細胞后導(dǎo)致Bcl-2的表達量降低，而Bax表達量增加，最終提升Bax/Bcl-2比率，激活caspase-3并增加其表達量。Bcl-2是一種抑制凋亡分子而Bax是一種促進凋亡的分子，兩者都是重要的凋亡通路調(diào)節(jié)分子[18-19]。Caspase-3是一種剪切酶，在激活凋亡通路中發(fā)揮著非同凡響的作用。當(dāng)細胞處于靜息狀態(tài)時，caspase-3以酶原形式定位于胞質(zhì)中，處于一種非激活的狀態(tài)。細胞凋亡信號通路一旦被激活，細胞質(zhì)中的多種蛋白水解酶將對caspase-3進行裂解，使得caspase-3進一步活化[20]。維替泊芬通過Bax/Bcl-2誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡，Bax/Bcl-2比例升高可活化PARP、caspase激酶活性，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的發(fā)生[21]。我們的研究結(jié)果同樣顯示維替泊芬可調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2及caspase-3促進腎癌769-P細胞凋亡。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)維替泊芬影響腎癌細胞生長周期，能將769-P細胞阻滯于G0/G1期，S期和G2/M期比例減少，抑制細胞增殖。熒光定量PCR及免疫印跡實驗結(jié)果顯示，經(jīng)維替泊芬藥物處理后腎癌769-P細胞的YAP、TEAD和CyclinD1蛋白表達量減少。研究發(fā)現(xiàn)在慢性粒細胞中，維替泊芬作用于癌細胞后可減少YAP及TEAD蛋白的表達，抑制YAP及TEAD蛋白的相互作用，進一步降低CyclinD1蛋白水平，阻滯癌細胞生長周期于G0/G1期，減少處于S期細胞數(shù)，降低癌細胞增殖率[22]。細胞周期蛋白依賴性激酶4簡稱CDK4，可促進細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化[23]，本研究發(fā)現(xiàn)維替泊芬可同時減少腎癌細胞的CyclinD1和CDK4表達量，抑制769-P細胞生長周期于G0/G1期，減少腎癌細胞的DNA合成量，進而抑制腎癌細胞生存能力。

綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)維替泊芬可抑制腎癌769-P細胞的生存、遷移及侵襲能力，阻滯癌細胞生長周期并促進細胞凋亡，為腎癌的治療提供新方向及新選擇。