新標(biāo)記物GATA3在乳腺癌替代分子分型中表達(dá)的敏感性分析

曾文欽，楊宇瓊，盧善明，朱文標(biāo)

嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院1解剖教研室，2病理教研室；3梅州市人民醫(yī)院//中山大學(xué)附屬梅州醫(yī)院病理科，廣東 梅州514031

GATA3結(jié)合蛋白（GATA3）在乳腺發(fā)育、乳腺腔上皮細(xì)胞分化還包括特定的泌尿上皮、表皮、一些皮膚附屬器中起重要作用[1-3]。GATA3表達(dá)還涉及乳腺癌的生長、分化、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移性[4-5]。GATA3表達(dá)于乳腺導(dǎo)管和小葉癌、泌尿上皮癌的診斷，最近報(bào)道它還表達(dá)于一些胰腺癌、間皮瘤、唾液腺瘤、滋養(yǎng)層腫瘤和內(nèi)胚竇瘤[2-3]。雖具有多重特異性，越來越多的證據(jù)表明GATA3在診斷原發(fā)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌是一個(gè)很有應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)記物[6-10]。在新的腫瘤標(biāo)記物GATA3輔助診斷乳腺癌之前，細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記物特異性囊腫病液體蛋白15（GCDFP15）和細(xì)胞膜標(biāo)記物人乳腺珠蛋白（MGB）是最常用于診斷乳腺癌的標(biāo)記物，它們雖顯示很好的特異性，卻缺乏敏感性，尤其在高級(jí)別乳腺癌如基底樣乳腺癌和三陰癌的診斷[11-12]。國內(nèi)外最新研究顯示GATA3在乳腺癌中的表達(dá)敏感性高于GCDFP15和MGB，尤其在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的鑒別診斷具有重要價(jià)值[9-10，13]；可這些研究主要涉及組織病理學(xué)分型、樣本類型或激素狀態(tài)而未涉及分子分型[8-10，13-14]。乳腺癌在分子水平上具有高度異質(zhì)性，即使組織形態(tài)相同，其分子遺傳學(xué)改變也可能不盡相同[15]，精確的掌握乳腺癌患者分子分型中GATA3的表達(dá)特征，是GATA3作為新的腫瘤標(biāo)記物診斷乳腺癌的前提條件。St. Gallen共識(shí)中也強(qiáng)調(diào)了乳腺癌多基因分子檢測技術(shù)的重要性，若由于標(biāo)本遞送問題或經(jīng)濟(jì)原因無法開展，可采用IHC檢測ER、PR，使用IHC和FISH檢測HER2過表達(dá)或擴(kuò)增來替代多基因分子分型法[16]；乳腺癌替代分子分型分為4型：HR陽性、HER2陰性型；HR陽性、HER2陽性型；HR陰性、HER-2陽性型；三陰型。本研究評(píng)估比較GATA3與傳統(tǒng)標(biāo)記物GCDFP15和MGB在原發(fā)和配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌的替代分子分型中的敏感性，為病理診斷不同分子分型的乳腺癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 分子分型與分組

收集2013年3月～2016年3月在梅州市人民醫(yī)院病理科確診的已做替代分子分型的原發(fā)和配對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者64例，St.Gallen國際共識(shí)雖強(qiáng)調(diào)了乳腺癌分子分型使用多基因分子檢測技術(shù)的重要性，若由于標(biāo)本遞送問題或經(jīng)濟(jì)原因無法開展，可采用替代分子分型法，運(yùn)用免疫組織化學(xué)（IHC）方法來檢測雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR），使用IHC或原位雜交檢測人表皮生長因子受體-2（HER2）過表達(dá)或擴(kuò)增，把乳腺癌替代分子分型分為4型：激素受體陽性、HER2陰性（A型）；激素受體陽性、HER2陽性（B型）；激素受體陰性、HER2陽性（C型）；三陰型（D型）。由于Ki-67可靠性較差，A型不再細(xì)分亞型，每型各16例。

1.2 制作組織芯片

每個(gè)供體蠟塊分別選取3個(gè)最有代表性的腫瘤區(qū)域穿刺構(gòu)建乳腺癌組織芯片，設(shè)計(jì)組織陣列點(diǎn)數(shù)為18，采用在鏡下容易識(shí)別的正常癌旁組織標(biāo)記方向，芯片上每個(gè)標(biāo)本直徑3.0 mm，相鄰兩樣本之間的距離為3 mm。

1.3 免疫組化染色

免疫組化采用EnVision兩步法。單克隆抗體GATA3-L，稀釋濃度1:50，購于Biocare Medical。多克隆抗體mammaglobin，稀釋濃度1:320，購于Zeta Corp。單克隆抗體GCDFP15，稀釋濃度1:40，購于Covance。HRP標(biāo)記的鼠兔通用型二抗購自Dako。實(shí)驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行，高溫高壓抗原修復(fù)；DAB顯色，蘇木精襯染。

1.4 結(jié)果判定

利用H-score（0～300）評(píng)分判定結(jié)果，即染色程度（0～3+）×染色范圍（0%～100%）所得。設(shè)定H-score評(píng)分得分界值≥50作為陽性結(jié)果評(píng)定3種抗體的敏感性。所有結(jié)果由本院高年資病理醫(yī)師分別計(jì)算，取兩者評(píng)分的均值，評(píng)分得分誤差大于5%的，由兩人達(dá)成一致后再計(jì)入結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析乳腺癌替代分子分型3種抗體的敏感性，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GATA3在乳腺癌替代分子分型的敏感性不同

GATA3、GCDFP15、MGB在A型原發(fā)性乳腺癌的敏感性分別為：81%、31%、13%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.609，P=0.000）；在A型配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的敏感性分別為：81%、44%、31%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.671，P=0.013）；在B型原發(fā)性乳腺癌的敏感性分別為：88%、13%、19%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.087，P=0.000）；在B型配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的敏感性分別為：81%、13%、31%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.609，P=0.000）；在C型原發(fā)性乳腺癌的敏感性分別為：63%、19%、38%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.284，P=0.049）；在C型配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的敏感性分別為：50%、19%、31%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.429，P=0.206）；在D型原發(fā)性乳腺癌的敏感性分別為：13%、25%、6%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.139，P=0.467）；在D型配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的敏感性分別為：13%、19%、19%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.436，P=1.000，表1）。

2.2 GATA3在乳腺癌替代分子分型的表達(dá)程度不同

GATA3在乳腺癌替代分子分型的表達(dá)程度不同。在A型和B型原發(fā)性乳腺癌的陽性樣本中，GATA3染色顯示彌漫的強(qiáng)陽性表達(dá)；但是在C型和

D型原發(fā)性乳腺癌的陽性樣本中，GATA3染色顯示低、中度表達(dá).GCDFP15和MGB在乳腺癌替代分子分型的表達(dá)沒有差異，GCDFP15染色顯示低、中度表達(dá)；MGB染色顯示中、高度表達(dá)。

表1 GATA3、GCDFP15、MGB在乳腺癌替代分子分型的敏感性比較

圖1 GATA3、GCDFP15、MGB在乳腺癌替代分子分型的表達(dá)

2.3 GATA3、GCDFP15、MGB在原發(fā)和配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌中表達(dá)的一致性比較

GATA3在原發(fā)和配對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌表達(dá)顯示很好的一致性，Kappa值為0.826＞0.75，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而GCDFP15的Kappa值為0.492＜0.75，MGB的Kappa值為0.593＜0.75（表2）。

表2 GATA3、GCDFP15、MGB在原發(fā)和配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌中表達(dá)的一致性

3 討論

GATA3在原發(fā)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌表達(dá)保持很好的一致性，雖然它的病理診斷價(jià)值有待進(jìn)一步的研究，但它在診斷乳腺癌中已成為新興實(shí)用的腫瘤標(biāo)記物，特別是在轉(zhuǎn)移性乳腺癌[3，6-7，9-10]。眾所周知，GCDFP15和MGB是診斷乳腺癌的傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)記物，它們有很好的特異性，但缺乏敏感性，尤其在高級(jí)別乳腺癌如基底樣癌和三陰癌表現(xiàn)最差[11-12]。最近研究報(bào)道：新的腫瘤標(biāo)記物GATA3在乳腺癌中的表達(dá)比傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)記物GCDFP15和MGB更敏感，可是，這些研究局限于標(biāo)本類型（組織或細(xì)胞標(biāo)本）、組織病理學(xué)分型或激素受體狀態(tài)[7-9，14]。Braxton等[8]發(fā)現(xiàn)GATA3在診斷轉(zhuǎn)移性乳腺癌的細(xì)胞標(biāo)本中比GCDFP15和MGB更敏感，GATA3染色程度與區(qū)域與ER陽性、PR陽性、HER2陽性正相關(guān)。Gregor等[7]的一項(xiàng)最新研究顯示GATA3在診斷三陰癌中是一個(gè)很實(shí)用的抗體，它比GCDFP15和MGB聯(lián)合檢測都更敏感，他們提議GATA3-L、GCDFP15和MGB聯(lián)合檢測是診斷三陰癌的最佳免疫標(biāo)記組合方案。Sangoi等[9]一項(xiàng)來自2015年的開創(chuàng)性研究表明：GATA3在乳腺癌mRNA水平的表達(dá)明顯高于GCDFP15和MGB，GATA3在原發(fā)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的陽性率明顯高于GCDFP15和MGB，可是這項(xiàng)研究只限于外科和細(xì)胞標(biāo)本類型、臨床腫瘤分型和分級(jí)，而ER、PR、HER2狀態(tài)未涉及。乳腺癌在分子水平上具有高度異質(zhì)性，即使組織形態(tài)相同，其分子遺傳學(xué)改變也可能不盡相同[15]，精確的掌握乳腺癌患者分子分型中GATA3的表達(dá)特征，是GATA3作為新的腫瘤標(biāo)記物診斷乳腺癌的前提條件，因此本論文進(jìn)行了GATA3在乳腺癌替代分子分型表達(dá)敏感性分析的這項(xiàng)研究，本研究發(fā)現(xiàn)：GATA3在乳腺癌替代分子分型中的敏感性有差異：GATA3在A型、B型和C型乳腺癌的敏感性優(yōu)于GCDFP15和MGB，與先前研究報(bào)道的一致，但是GATA3在D型乳腺癌的敏感性并未優(yōu)于GCDFP15和MGB?；诒狙芯拷Y(jié)論GATA3在不同分子亞型乳腺癌的診斷價(jià)值不同，應(yīng)重新評(píng)估GATA3在D型乳腺癌的診斷價(jià)值。

若由于標(biāo)本遞送問題或經(jīng)濟(jì)原因無法開展，可采用IHC檢測ER、PR、HER2，HER2為IHC2+不確定病例，需再進(jìn)一步應(yīng)用FISH檢測基因擴(kuò)增。本論文研究通過上述方法篩選和定義的替代分子分型包括ER、PR陽性、HER2陰性；ER、PR陽性、HER2陽性；ER、PR陰性、HER2陽性；三陰型；由于通過IHC檢測表示細(xì)胞增殖活性的Ki-67存在爭議，故本研究對(duì)A型不再細(xì)分亞型。單獨(dú)列出ER、PR陽性、HER2陽性，即B型，強(qiáng)調(diào)HER2陽性在HR陽性乳腺癌的作用。

GATA3在乳腺癌的敏感性介于2.6%～100%，尤其在ER陰性相關(guān)乳腺癌的陽性率波動(dòng)范圍很大，可能解釋的原因與組織芯片的應(yīng)用有關(guān)：組織芯片會(huì)低估GATA3的陽性率，與針芯活組織檢查相比局限于標(biāo)本大小，在不同的研究中每個(gè)標(biāo)本點(diǎn)數(shù)的多少和點(diǎn)的大小有差異；有一篇研究報(bào)道使用組織芯片每個(gè)腫瘤一個(gè)點(diǎn)直徑大小為0.6 mm的方法發(fā)現(xiàn)GATA3在ER陽性乳腺癌的敏感性為39%，在ER陰性乳腺癌的敏感性為2.6%[16-17]。本研究在每個(gè)供體選取3個(gè)最有代表性的腫瘤區(qū)域穿刺，點(diǎn)直徑大小為3.0 mm，構(gòu)建乳腺癌組織芯片。判讀陽性結(jié)果的界值不同也影響GATA3的敏感性，據(jù)研究報(bào)道定義GATA3核染色結(jié)果陽性的范圍從任何核染色[3]、或至少達(dá)到1%的核染色[18]、或達(dá)到10%的核染色[19]，過渡達(dá)到20%以上的核染色[20]；本研究參照Ankur等[9]H-score評(píng)分：根據(jù)染色程度和染色范圍計(jì)算得出一個(gè)數(shù)值，設(shè)定H-score評(píng)分得分界值≥50作為陽性結(jié)果評(píng)定3種抗體的敏感性。根據(jù)GATA3的相關(guān)研究報(bào)道，在市場上有兩家抗體供應(yīng)商可供選擇，一家是來自Santa Cruz的克隆HG3-31，另外一家是來自Biocare Medical的克隆L50-823。有研究[13]在相同的腫瘤中比較這兩種抗體發(fā)現(xiàn)L50-823比HG3-31更敏感，故本研究僅選用L50-823作為研究使用的抗體。

本研究中若不涉及分子分型，GATA3在原發(fā)和配對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的表達(dá)優(yōu)于GCDFP15和MGB，正如先前研究[9]報(bào)道，可是在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的敏感性為78%，而不是文獻(xiàn)報(bào)道的95%，分子分型可能是其中一個(gè)混雜因素。GATA3在A型和B型原發(fā)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的敏感性增加到81%～88%，明顯優(yōu)于GCDFP15和MGB；而且GATA3在A型和B型乳腺癌的陽性標(biāo)本中顯示高表達(dá)，這些結(jié)果表明GATA3與ER陽性明顯相關(guān)，正如先前研究所報(bào)道[8，21]。GATA3在C型乳腺癌的敏感性也優(yōu)于GCDFP15和MGB，GATA3在C型原發(fā)和配對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的敏感性分別為63%和50%，雖GATA3在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的敏感性與其它兩種抗體相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示沒有顯著差異；另外，GATA3在C型乳腺癌陽性標(biāo)本顯示中、低表達(dá)，這也解釋了ER作為獨(dú)立因素影響GATA3的調(diào)節(jié)；然而GATA3在ER陰性相關(guān)乳腺癌表現(xiàn)的敏感性也映射出多重ER通路影響GATA3的調(diào)節(jié)。在本論文研究中GATA3在D型乳腺癌的敏感性沒有優(yōu)于GCDFP15和MGB，在H-score評(píng)分界值≥50作為陽性結(jié)果的敏感性僅為13%。本研究使用IHC和FISH嚴(yán)格控制分子分型的篩選；H-score評(píng)分界值的設(shè)定，基底樣乳腺癌患者比重大可能是影響陽性結(jié)果偏低的原因；而且GATA3在D型陽性標(biāo)本中顯示低表達(dá)，正好解釋了其低敏感性的原因，更何況三陰癌以基底樣乳腺癌為主，其來源于乳腺肌上皮細(xì)胞，肌上皮細(xì)胞本身不表達(dá)GATA3。

GATA3在原發(fā)和配對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的表達(dá)保持高度的一致，Kappa值為0.826，與研究[9]報(bào)道的結(jié)果一致；如此可以推論：如果GATA3在原發(fā)性乳腺癌表達(dá)陽性，不太可能在轉(zhuǎn)移性乳腺癌表達(dá)缺失，此外，除了皮膚附屬結(jié)構(gòu)，使用很少出現(xiàn)在未知組織來源轉(zhuǎn)移灶的GCDFP15和MGB作為內(nèi)對(duì)照，從而支持乳腺組織來源腫瘤。

GATA3在乳腺癌分子分型的敏感性有差異；GATA3在A型和B型乳腺癌的敏感性明顯優(yōu)于GCDFP15和MGB，顯示其高敏感性和高表達(dá)；GATA3雖在C型乳腺癌的敏感性也高于GCDFP15和MGB，可是顯示其中、低表達(dá)和敏感性不穩(wěn)定；GATA3在三陰癌的敏感性表現(xiàn)最差，與GCDFP15和MGB相比沒有顯示其優(yōu)越性；從本論文研究結(jié)論得出：GATA3在不同分子亞型乳腺癌的診斷價(jià)值不同，應(yīng)慎重選擇GATA3用于三陰癌的病理診斷，GATA3在雌激素受體陰性乳腺癌的病理診斷價(jià)值有待進(jìn)一步的評(píng)估。GATA3表達(dá)與ER、PR和HER2陽性有關(guān)；GATA3在原發(fā)和配對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌保持高度的一致性，可以支持未知組織來源的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的診斷。GATA3的作用在乳腺癌中是否與雌激素受體一樣作為預(yù)后或預(yù)測指標(biāo)的獨(dú)立因素還不確定，進(jìn)一步闡明GATA3在乳腺癌特別是雌激素受體陰性乳腺癌和三陰癌中的功能是今后研究的方向。