酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇的研究進(jìn)展

程磊，宗朕，陳卓靜，王磊，汪超，祁勇剛，柳志杰

(湖北工業(yè)大學(xué)工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068)

赤蘚糖醇是一種四碳糖醇，具有熱量低，人體耐受性高，防齲齒，不引起血糖變化，改善膚質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，可以作為甜味劑添加到食品和日化消費(fèi)品中[1,2]。赤蘚糖醇同時(shí)還具有儲(chǔ)熱密度大、無(wú)腐蝕性、熱穩(wěn)定性好的理化性質(zhì)，可用于制備優(yōu)良的相變材料[3]。赤蘚糖醇因其廣闊的應(yīng)用前景，逐漸被重視。目前主要通過(guò)化學(xué)法、微生物發(fā)酵法生產(chǎn)赤蘚糖醇?；瘜W(xué)法是將淀粉用高碘酸法生成雙醛淀粉，在高溫高壓條件下，鎳作為催化劑，雙醛淀粉經(jīng)氫化裂解成赤蘚糖醇及其他衍生物[4]。另外，祁廣賓等以葡萄糖鈉為原料氧化、加氫制備赤蘚糖醇[5]。但化學(xué)法存在流程長(zhǎng)、成本高、產(chǎn)物選擇性低、安全性差等諸多問(wèn)題，而微生物發(fā)酵法具有反應(yīng)溫和、成本低廉、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)，因而更加廣泛應(yīng)用于赤蘚糖醇的工業(yè)化生產(chǎn)，其中主要使用的菌種是耐高滲透酵母，包括Pichia(畢赤氏酵母屬)，Candida(假絲酵母)，Torulopsis(球擬酵母屬)，Trigonopsis(三角酵母屬)，Moniliella(叢梗孢酵母屬)，Trichospornides(絲孢酵母屬)，Yarrowia(耶氏酵母屬)，Hansenula(漢森(氏)酵母屬)等[6]。本文主要從菌種選育、赤蘚糖醇的合成途徑、基因工程和發(fā)酵工藝四個(gè)方面闡述酵母菌生產(chǎn)赤蘚糖醇的研究進(jìn)展，為提升酵母菌生產(chǎn)赤蘚糖醇的能力提供了參考，進(jìn)而推動(dòng)了微生物發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 赤蘚糖醇特性

赤蘚糖醇的化學(xué)名是1，2，3，4-丁四醇，分子式為C4H10O4，白色無(wú)味晶體，赤蘚糖醇吸濕性低，結(jié)晶性好，易粉碎制得粉狀產(chǎn)品，其吸濕性在糖醇及蔗糖等甜味劑中是最小的。赤蘚糖醇的熔點(diǎn)為118～122 ℃，沸點(diǎn)為329～331 ℃，熱穩(wěn)定性高，即使在160 ℃高溫環(huán)境中也不發(fā)生分解及變色，避免了食品在高溫加工過(guò)程中出現(xiàn)焦化，并且在pH 2～12的條件下穩(wěn)定，符合一般食品對(duì)酸堿的要求。因?yàn)槌嗵\糖醇化學(xué)結(jié)構(gòu)中無(wú)羰基，所以在與氨基酸共存的條件下不發(fā)生美拉德反應(yīng)。其甜度約為蔗糖的75%，甜味純正，后味消失快，與其他甜味劑復(fù)配使用，如乙酰碘氨酸鉀、天冬酰苯氨酸甲酯等，能改善、協(xié)調(diào)味質(zhì)的作用[7]。赤蘚糖醇實(shí)際為人體提供的熱量值在諸多糖醇類甜味劑中是最低的，被人體吸收后的赤蘚糖醇分子不能被機(jī)體內(nèi)的酶系統(tǒng)分解，不為機(jī)體提供熱量，不參與糖代謝引起血糖變化，只能透過(guò)腎臟從血液濾出，隨尿液從人體排出。赤蘚糖醇的生物耐受性高，安全無(wú)毒，無(wú)致畸、致癌、誘導(dǎo)染色體變異等副作用[8]。赤蘚糖醇不能被口腔中的變異鏈球菌等細(xì)菌發(fā)酵利用，不會(huì)導(dǎo)致口腔中pH的變化，不會(huì)產(chǎn)生牙菌斑，而且赤蘚糖醇能抑制口腔鏈球菌的生長(zhǎng)和生物膜的形成,因而赤蘚糖醇可以降低齲齒風(fēng)險(xiǎn)[9]。

2 生產(chǎn)赤蘚糖醇的酵母菌選育

酵母菌與霉菌、細(xì)菌相比，其安全性、赤蘚糖醇生產(chǎn)能力和產(chǎn)物選擇性占有明顯優(yōu)勢(shì)，因而酵母菌是比較適合生產(chǎn)赤蘚糖醇的菌種，工業(yè)上生產(chǎn)赤蘚糖醇的菌種大部分是酵母菌。產(chǎn)赤蘚糖醇的野生型酵母主要是從土壤、花粉、蜂蜜、蜂巢和發(fā)酵食品中分離獲得，然后對(duì)野生型菌種篩選、純化、誘變育種獲得高產(chǎn)赤蘚糖醇的酵母菌。1950年，Binkley等首次發(fā)現(xiàn)酵母菌生產(chǎn)赤蘚糖醇[10]。1956年，Spencer 等在研究耐高滲酵母產(chǎn)甘油時(shí)，發(fā)現(xiàn)酵母菌的培養(yǎng)條件與生長(zhǎng)速度的改變，可生產(chǎn)赤蘚糖醇[11]。1964年，Hajny等從新鮮花粉中分離出1株圓酵母(Torulasp.) ，赤蘚糖醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)到 35%～40%。1998年，Park 等從蜂巢中分離得到的耐高滲酵母(Trichosporonsp.)，赤蘚糖醇產(chǎn)量可達(dá)到209 g/L[12，13]。2001年，Shie-Jea Lin等從花粉和蜂蜜中分離出6株產(chǎn)赤蘚糖醇的耐高滲透酵母，其生產(chǎn)赤蘚糖醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)37%。2010年，Shie-Jea Lin等又從蜂蜜中分離出1株高產(chǎn)赤蘚糖醇的叢梗孢酵母(Moniliellasp.)，但該菌種對(duì)赤蘚糖醇有較強(qiáng)的吸收能力[14]。然后該課題組采用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)誘變后篩選得到N61188-12,該菌株對(duì)赤蘚糖醇的吸收較弱，在2000 L的發(fā)酵罐中經(jīng)過(guò)10天發(fā)酵，赤蘚糖醇產(chǎn)量達(dá)189.4 g/L[15]。2008年，Waldemar Rymowicz等篩選的突變型Y.lipolyticaWratislavia K1,赤蘚糖醇的產(chǎn)量達(dá)170 g/L,轉(zhuǎn)化率為56%。2014年，Waldemar Rymowicz等進(jìn)一步采用紫外線誘變Wratislavia K1，得到突變型菌株MK1，其赤蘚糖醇的最高產(chǎn)量為224 g/L,轉(zhuǎn)化率為77%，而所得到的副產(chǎn)物總量低于2.3%[16]。2016年，Liu Xiaoyan等通過(guò)常壓室溫等離子體突變系統(tǒng)誘變野生型Y.lipolyticaSWJ-1b,隨后從該株菌的突變菌株中篩選出了菌種M53，生產(chǎn)赤蘚糖醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)64.8%[17]，而且菌種M53能夠?qū)U棄的食用油作為碳源生產(chǎn)赤蘚糖醇，降低了生產(chǎn)成本[18]。

國(guó)內(nèi)對(duì)于產(chǎn)赤蘚糖醇菌種的研究較晚，徐虹等、范光先等、吳燕等、葉嫻等、王鳳偉等從不同材料中分離得到的產(chǎn)赤蘚糖醇的酵母菌，但赤蘚糖醇的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率均偏低[19-23]。

3 赤蘚糖醇的合成途徑

酵母菌能夠分別利用葡萄糖和甘油合成赤蘚糖醇，其中葡萄糖主要來(lái)源于淀粉質(zhì)原料的酶解，獲取成本較高。甘油可作為副產(chǎn)物從生物燃料生產(chǎn)過(guò)程中獲取，成本低廉，而且所具備的高滲透壓特性能增強(qiáng)酵母菌生產(chǎn)赤蘚糖醇的能力[24],酵母菌以甘油為基質(zhì)生產(chǎn)赤蘚糖醇的代謝途徑復(fù)雜，其中涉及的酶和中間產(chǎn)物較多，此代謝途徑有更大的研究潛力。以下分別介紹酵母菌以葡萄糖和甘油為基質(zhì)生產(chǎn)赤蘚糖醇的代謝途徑。

酵母菌生產(chǎn)赤蘚糖醇的主要途徑是在需氧條件下，通過(guò)磷酸戊糖途徑生產(chǎn)赤蘚糖醇，見(jiàn)圖1。

圖1 酵母菌利用葡萄糖生產(chǎn)赤蘚糖醇

葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后在轉(zhuǎn)酮酶的催化下轉(zhuǎn)化為4-磷酸赤蘚糖，進(jìn)一步在4-磷酸赤蘚糖激酶的去磷酸化作用下生成赤蘚糖醇，最后在赤蘚糖還原酶催化加氫作用下生成赤蘚糖醇[25]。

酵母菌通過(guò)磷酸化途徑利用甘油生產(chǎn)赤蘚糖醇[26]。在發(fā)酵底物中，作為碳源的甘油被甘油激酶磷轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸，進(jìn)一步脫氫形成二羥丙酮磷酸,然后在異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的作用下轉(zhuǎn)化為赤蘚糖-4-磷酸和其他代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)磷酸戊糖途徑，脫磷酸生成赤蘚糖，最終在赤蘚糖還原酶的作用下脫氫形成赤蘚糖醇，見(jiàn)圖2。

圖2 酵母菌利用甘油生產(chǎn)赤蘚糖醇

在該代謝途徑中，轉(zhuǎn)酮醇酶是關(guān)鍵性的酶，對(duì)赤蘚糖-4-磷酸的代謝量有顯著的影響，進(jìn)而影響赤蘚糖醇的最終產(chǎn)量[27]。

4 基因工程改造酵母菌

酵母菌在利用甘油合成赤蘚糖醇的途徑中存在許多關(guān)鍵性的酶，如轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛醇和赤蘚糖醇還原酶等，對(duì)酵母菌的赤蘚糖醇產(chǎn)量有極大的影響[28]。采用基因工程的方法對(duì)產(chǎn)赤蘚糖醇的酵母基因序列的修飾，影響相關(guān)酶的基因表達(dá)量，最終可以實(shí)現(xiàn)增加赤蘚糖醇的生產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的目的。近年來(lái)，研究者還發(fā)現(xiàn)了酵母菌以赤蘚糖醇作為碳源表達(dá)的關(guān)鍵基因，敲除該基因進(jìn)一步增加了酵母菌的赤蘚糖醇最終產(chǎn)量[29,30]。

Dorota A Rzechonek等發(fā)現(xiàn)突變型Y.lipolyticaWratislavia K1無(wú)法分解利用赤蘚糖醇，但是Wratislavia K1的突變型菌株MK1能在赤蘚糖醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。采用反轉(zhuǎn)錄PCR分析MK1，顯示突變型菌株MK1中基因EUF1(YALI0F01562g)表達(dá)量顯著增加。進(jìn)一步敲除了菌株AMM(由MK1衍生)中基因序列EUF1，發(fā)現(xiàn)菌株AMM無(wú)法在赤蘚糖醇為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，確定了EUF1是酵母菌利用赤蘚糖醇的關(guān)鍵基因序列。Carly F等在研究中證實(shí)了酵母中的基因EYK1(YALI0F01606g)是酵母菌分解利用赤蘚糖醇的關(guān)鍵基因，該基因表達(dá)赤蘚酮糖激酶。Tomasz Janek等超量表達(dá)酵母菌中編碼赤蘚糖還原酶的基因(YALI0F18590g)，赤蘚糖醇的最終產(chǎn)量比對(duì)照組高20%[31]。Aleksandra M等構(gòu)建了工程菌AJD pADUGut1/2，同時(shí)超量表達(dá)基因GUT1(表達(dá)甘油激酶)和GUT2(表達(dá)甘油-3-磷酸脫氫酶)，增加了赤蘚糖醇代謝途徑中的中間體，該株菌的赤蘚糖醇產(chǎn)量比對(duì)照組增加了35%[32]。Frédéric Carly等重新構(gòu)建的菌株FCY214，超量表達(dá)基因GUT1(表達(dá)甘油激酶)、TKL1(表達(dá)轉(zhuǎn)酮醇酶)，比母本菌株的生產(chǎn)速率提升了75%，然后敲除了FCY214中基因EYK(表達(dá)赤蘚酮糖激酶)，使該菌種無(wú)法利用赤蘚糖醇作為碳源[33]。

5 發(fā)酵工藝

優(yōu)質(zhì)菌種是生產(chǎn)目的產(chǎn)物的重要因素，優(yōu)良的發(fā)酵工藝則能進(jìn)一步提升發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。近年來(lái)，研究者們對(duì)赤蘚糖醇發(fā)酵工藝的研究主要集中于培養(yǎng)基組分和滲透壓。

5.1 培養(yǎng)基組分

Ludwika Tomaszewska等研究了酵母提取物、胰蛋白胨、(NH4)SO4、玉米漿等作為氮源和維生素來(lái)源對(duì)Y.lipolyticaWratislavia K1生產(chǎn)赤蘚糖醇過(guò)程的影響，發(fā)現(xiàn)酵母提取物是Wratislavia K1的最佳氮源和維生素來(lái)源。Wratislavia K1在325 kg/m3的高濃度底物分批發(fā)酵168 h后，赤蘚糖醇的產(chǎn)量達(dá)325 kg/m3，并且在消耗了部分甘油后添加酵母提取物，副產(chǎn)物明顯減少，其總量沒(méi)有超過(guò)10%[34]。Rywinska,Anita等采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了菌種Wratislavia K1的培養(yǎng)基組分，(NH4)SO4,KH2SO4,NaCl添加量分別為2.25,0.22,26.4 g/L，碳氮比例為81∶1。菌株Wratislavia K1在添加了100 g/L甘油的該培養(yǎng)基中，赤蘚糖醇的生產(chǎn)量為46.9 g/L，轉(zhuǎn)化率為47%[35]。Magdalena Rakicka等研究的結(jié)果顯示Y.lipolyticaMK1以甘為碳源的培養(yǎng)基中最適碳氮比例是80∶1，在該條件下，菌種MK1生產(chǎn)赤蘚糖醇的最高產(chǎn)量為113.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為58%[36]。

此外，在培養(yǎng)基中添加輔助物質(zhì)能提升酵母菌生產(chǎn)赤蘚糖醇的能力。過(guò)高的滲透壓會(huì)抑制酵母生長(zhǎng)，甚至使發(fā)酵過(guò)程停滯，降低赤蘚糖醇的生產(chǎn)率[37]。楊利博等向培養(yǎng)基中添加甘氨酸、脯氨酸協(xié)助酵母菌抵抗高滲透壓，顯著減輕了高滲透壓對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的抑制效果，提升了赤蘚糖醇的生產(chǎn)能力[38]。Ludwika Tomaszewska首次研究了銅、鐵、錳、鋅離子對(duì)Y.lipolytica生產(chǎn)赤蘚糖醇能力的影響，其中錳離子促進(jìn)作用最顯著，菌株Wratislavia K1在添加了錳離子的培養(yǎng)基中赤蘚糖醇的生產(chǎn)量比對(duì)照組提升了14.5%，赤蘚糖還原酶活力提升至對(duì)照組的1.3倍[39]。表面活性劑能提升細(xì)胞膜通透性，進(jìn)而提升菌種代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)量，Magdalena Rakicka等對(duì)比了3種表面活性劑Triton X-100,Span 20和Tween 80對(duì)菌株Wratislavia K1生產(chǎn)赤蘚糖醇的影響，結(jié)果顯示Span 20組的赤蘚糖醇產(chǎn)量比對(duì)照組提升了15%[40]。

5.2 滲透壓

高滲透壓環(huán)境有利于酵母菌合成赤蘚糖醇,但是其中的機(jī)理及滲透壓的控制模式尚處于研究階段。Yang Li-bo等在Y.lipolytica分批補(bǔ)料式發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇中，首次采用了1種NaCl控制兩階段滲透壓的策略。第一階段(0～96 h)維持滲透壓處于4.25 osmol/kg的較低水平以減少對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制，第二階段(132～196 h)控制滲透壓至4.94 osmol/kg使赤蘚糖醇的生產(chǎn)速率保持高水平，赤蘚糖醇的最高產(chǎn)量和生產(chǎn)速率比第一階段分批補(bǔ)料發(fā)酵提升了25.7%，2.2%，達(dá)到了194.3，0.95 g/L/h。Ludwika Tomaszewska-Hetman等進(jìn)一步研究了高滲透壓Y.lipolytica的影響，菌株A-3以甘油為基質(zhì)，置于75 g/dm3NaCl的高滲透壓環(huán)境中，甘油激酶和甘油-3-磷酸脫氫酶的活力分別下降了78%，25%，而轉(zhuǎn)酮醇酶和赤蘚糖還原酶的活力沒(méi)有變化。Yang Li-bo 等通過(guò)分析Y.lipolytica在高滲透壓環(huán)境中，與能量、新陳代謝、細(xì)胞修復(fù)、應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)的54種蛋白質(zhì)，該課題組發(fā)現(xiàn)Y.lipolytica在高滲透壓環(huán)境中能提升赤蘚糖醇的生產(chǎn)能力主要是因?yàn)楦邼B透壓引起轉(zhuǎn)酮醇酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和滲透壓應(yīng)激蛋白類的表達(dá)顯著增強(qiáng)[41]。

6 展望

目前研究者已經(jīng)通過(guò)自然選育和誘變育種篩選出具備高產(chǎn)量和高產(chǎn)率的優(yōu)良酵母菌菌種，并且優(yōu)化了發(fā)酵工藝，進(jìn)一步提高了赤蘚糖醇的產(chǎn)量。但是高滲透壓對(duì)酵母菌合成赤蘚糖醇影響機(jī)理的研究依然停留在相關(guān)蛋白質(zhì)水平,后續(xù)可以結(jié)合基因工程和代謝組學(xué)深入研究，鑒定其中涉及的酶及基因，對(duì)酵母菌合成赤蘚糖醇的代謝途徑進(jìn)行更加精準(zhǔn)的調(diào)控，提高赤蘚糖醇的產(chǎn)量。