低鹽脅迫對5個海水稻種質(zhì)若干生理生化指標的影響

王旭明 趙夏夏 陳景陽 李震 陳佳媚 許江環(huán) 周鴻凱

摘要 以HH11、R15A14、Pokkali、FL478、IR29為材料，設0、2.5g/kg NaCl兩種鹽脅迫處理進行盆栽試驗，研究不同鹽濃度對水稻葉片的光合速率、葉綠素含量、游離脯氨酸含量、丙二醛含量、細胞膜透性以及農(nóng)藝性狀的影響。結(jié)果表明：在低鹽脅迫條件下，HH11、R15A14與耐鹽基因型（Pokkali和FL478）和鹽敏感基因M（IR29）水稻相比：（1）5個海水稻葉綠素含量沒有顯著性差異，但是HH11低于pokkali而高于FL478耐鹽品種;海水稻在低鹽脅迫下光合速率變化較小，并且維持在較高水平;（2）不同海水稻體內(nèi)的游離脯氨酸維持在較高水平，而HH11游離脯氨酸含量達到最大值;（3）HH11、R15A14和FL478丙二醛含量相近;相比其他種質(zhì)，R15A14和Pokkali細胞膜透破壞程度相對較小，細胞膜透性仍處于穩(wěn)定狀態(tài);（4）低鹽脅迫下植株細胞聚集大量的丙二醛，細胞膜透性受傷害程度加劇，從而造成光合速率下降;而脯氨酸作為小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以緩解細胞滲透壓，維持細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而維持水稻植株葉片可以進行正常光合速率，植株保持正常生命活動;（5）HH11和R15A14這2份海水稻種質(zhì)在鹽脅迫下仍能進行正常生長并且具有顯著抗鹽脅迫能力，表現(xiàn)了較好的耐鹽堿性，可作為耐鹽堿燦稻資源加以利用。

關(guān)鍵詞 海水稻;低鹽脅迫;耐鹽性;生理生化特性

中圖分類號 S511 文獻標識碼 A

目前，全世界大約有20%農(nóng)業(yè)用地的鹽堿化程度在不斷加重，預計到2050年將會有超過50%的耕地變得鹽堿化[1]。鹽脅迫又是目前制約農(nóng)作物產(chǎn)量的主要逆境因素之一[2]，既有滲透脅迫又有離子脅迫[3]。水稻（Oryza sativa L.）既是禾本科植物的模式物種，也是一種對鹽中度敏感的作物，可作為鹽堿地開發(fā)利用的先鋒植物。因此，水稻耐鹽性問題成為一個研究熱點。高顯穎研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤鹽濃度的增加，水稻的生育期延長、株高變矮、莖粗變細、有效穗數(shù)和產(chǎn)量有較大幅度地下降[4]。鹽脅迫下水稻葉片中有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性糖、可溶性蛋白以及脯氨酸）以及抗氧化酶（SOD、POD以及CAT）活性受脅迫強度和脅迫時間影響，噴施脯氨酸降低了MDA含量，有效抑制了膜脂過氧化Nguyen等[6]發(fā)現(xiàn)，在6d鹽脅迫處理下的植株莖內(nèi)鹽誘導出一些含氮化合物，包括游離氨基酸和胺腮類物質(zhì)，特別是脯氨酸含量顯著增加并且游離氨基酸在莖的累積量隨著NaCl濃度的增加而增加。汪宗立等[7]試驗也證明，土壤鹽漬下水稻連體葉片電解質(zhì)外滲率增加，相對電導率增大程度與葉片傷害癥狀相一致，在追究質(zhì)膜傷害的原因時發(fā)現(xiàn)，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA在受鹽害的水稻葉片中有大量的積累，并且MDA的增加與質(zhì)膜透性的增大呈極顯著的正相關(guān)。在一定NaCl濃度范圍內(nèi)，SOD和POD的活性與脅迫強度成正相關(guān)，游離脯氨酸和可溶性糖的含量也隨著NaCl濃度的增加而增加，而CAT活性卻沒有規(guī)律性變化[8]。然而，低鹽脅迫對5個海水稻種質(zhì)的生理生化特征和農(nóng)藝性狀的影響及耐用性分析方面鮮有報道。因此，本文在低鹽（2.5g/kg）脅迫下，對海水稻生理生化指標、農(nóng)藝性狀進行綜合分析與評價，以期探索5個水稻耐鹽種質(zhì)對低鹽脅迫的生理生化響應機制，旨為選育耐鹽水稻耐鹽品種以及利用海水稻對鹽堿地土壤改良和生態(tài)修復提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料品種為HH11、R15A14、Pokkali、FL478、IR29種子。其中Pokkali和FL478為國際水稻所提供的耐鹽基因型海水稻品種，IR29為國際水稻所提供的感鹽敏感基因型品種，HH11、R5A14海水稻均有廣東海洋大學農(nóng)學院提供。

1.2 方法

1.2.1 水稻幼苗的培養(yǎng)

人工精選飽滿籽粒，先用蒸餾水浸泡5min后，去除不實籽粒。用10%的H₂O₂浸泡 20min后，用去離子水沖洗干凈并均勻平鋪于無菌培養(yǎng)皿中，放置30℃種子培養(yǎng)箱下催芽48h，期間換水6次并保持培養(yǎng)皿濕潤，待種子露白后種植于廣東海洋大學農(nóng)學院水稻實驗田中進行幼苗培育。

1.2.2 鹽脅迫處理

取過篩后的風干基土作為鹽脅迫對照組，按照土壤含鹽量百分比計算[土壤含鹽量百分比=m（NaCl）/m（土壤）]，在此基土上添加不同質(zhì)量的鹽脅迫添加劑氯化鈉（分析純，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)），依次形成0，0.25g/kg氯化鈉處理組，每桶施4g復合肥作為基肥，隨機區(qū)組試驗設計，2個處理，每個處理組合15桶，共30桶。

選取長勢均勻的3葉1心期的秧苗，移栽到試驗桶中，6株/桶。將試驗桶放在農(nóng)研所溫室內(nèi)，每桶保持2cm水層，每桶插入相同刻度的標尺測定其水位，根據(jù)缺水情況，每桶補水至相同刻度。生長期間早晚觀察水稻的生長狀況，每天拍照記錄，并除去雜草。并使用土壤含鹽量測試儀（臺灣衡欣Az8371型）監(jiān)測桶內(nèi)土壤含鹽量，以保證整個生長過程桶內(nèi)土壤含鹽量長期保持相對穩(wěn)定。

1.2.3 光合速率測定

光合速率測定方法[9]，利用LI-6400型便攜式光合測定系統(tǒng)對水稻葉片進行光合速率測定。晴天的09：00～11：30，選取灌漿期大小相似的水稻葉片進行測定。每一海水稻取3株，每株做3個平行重復實驗進行光合速率測定，計算結(jié)果取平均值。

1.2.4 生理生化指標的測定

選取灌漿期大小相似的水稻葉片進行測定。每一海水稻取3株，每株做3個平行重復實驗，計算結(jié)果取平均值。葉綠素含量的測定采用浸提法[10];丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸顯色法（TBA）法[11];細胞膜透性的測定按照汪月霞等的方法[12]進行;脯氨酸（Pro）含量的測定采用磺基水楊酸法[13]進行。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS軟件分析處理水稻灌漿期生理生化的指標數(shù)據(jù)，采用Duncan法進行兩兩比較。作圖用Microsoft Excel 2007完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 低鹽脅迫對5個海水稻葉片葉綠素含量的影響

由圖1可以看出，對照組中水稻不同種質(zhì)體內(nèi)葉綠素含量均高于鹽脅迫組，其中HH11，R15A14相差達到兩倍而且在低鹽脅迫處理下5個海水稻的葉綠素含量均下降了。Pokkali，HH11，R15A14葉綠素含量受鹽脅迫的影響程度相似。說明鹽脅迫阻礙了水稻葉片葉綠素含量的合成，但是FL478，IR29受鹽脅迫的影響較小。

2.2 低鹽脅迫對水稻不同種質(zhì)灌漿期葉片光合速率的影響

圖2顯示，不同的海水稻光合速率對照組高于鹽脅迫組。鹽脅迫下的5個海水稻凈光合速率強弱的排序為Pokkali>HH11>R15A14>IR29>FL478。對照組凈光合速率強弱排序為Pokkali>HH11>R15A14>IR29>FL478。經(jīng)方差分析得，對照組各組呈現(xiàn)顯著性差異（p<0.05）。HH11，R15A14和Pokkali三個海水稻對照組和鹽脅迫組光合速率變化較小，并且3個海水稻光合速率維持在較高水平。5個海水稻中，Pokkali光合速率相對于其他4個種質(zhì)較強，HH11和R15A14兩種海水稻的光合速率與Pokkali較為接近。

2.3 低鹽脅迫對水稻不同種質(zhì)灌漿期葉片脯氨酸含量的影響

圖3顯示，在鹽脅迫條件下，游離脯氨酸在不同海水稻中均有不同程度的積累。鹽脅迫組不同海水稻體內(nèi)游離脯氨酸含量均高于對照組，而且R15A14，F(xiàn)L478，IR29與對照組相比脯氨酸含量的積累相差3倍，HH11體內(nèi)游離脯氨酸積累最多，HH11，R15A14脯氨酸的積累超過了Pokkali，F(xiàn)L478這2個耐鹽基因型品種。根據(jù)方差分析得，鹽脅迫組HH11與其他4個品種間存在顯著性差異（p<0.05）。HH11種質(zhì)在受到低鹽脅迫影響下積累大量的游離脯氨酸來抵抗?jié)B透脅迫是有效的滲透調(diào)節(jié)的體現(xiàn)，以能維持正常的生理活動。

2.4 低鹽脅迫對水稻不同種質(zhì)灌漿期葉片丙二醛（MDA）含量的影響

從圖4可以看出，在水稻灌漿期，低鹽脅迫下5個海水稻體內(nèi)MDA含量均遠遠高于對照組。其中，在R15A14和pokkali兩個海水稻低鹽脅迫下MDA含量大約是對照組的6倍。方差分析顯示，低鹽脅迫下HH11、R15A14和FLA78這3個海水稻體內(nèi)MDA含量無明顯差異（p>0.05）。Pokkali與HH11、R15A14、FLA78、IR29這4個品種間有顯著性差異（p<0.05））。IR29與HH11、R15A14、FL478這3個品種間也存在顯著性差異（p<0.05）。由于鹽脅迫下水稻體內(nèi)膜脂過氧化，使得不同海水稻體內(nèi)MDA含量維持較高水平。

2.5 低鹽脅迫對水稻不同種質(zhì)灌漿期葉片細胞質(zhì)膜透性的影響

圖5顯示，低鹽脅迫處理后不同海水稻幼苗相對電導率均呈不同程度的增加。在鹽脅迫下，細胞膜受損情況明顯。方差分析表明，在低鹽脅迫下5個海水稻中HH11與FL478的電導率無顯著性差異（p>0.05）。Pokkali、R15A14與IR29這3個種質(zhì)間的電導率無顯著性差異（p>0.05）。HH11與Pokkali、R15A14和IR29這3個種質(zhì)間的細胞質(zhì)電導率存在顯著性差異（p<0.05）。FLA78與Pokkali，R15A14和IR29這3個品種間同樣存在顯著性差異（p<0.05）。其中，膜透性HH11與FL48相近，R15A14與Pokkali較為相近。

2.6 低鹽脅迫對水稻不同種質(zhì)灌漿期生理生化指標之間的相關(guān)性分析

參照周鴻凱等[14]的方法，通過雙變量相關(guān)性分析對丙二醛、脯氨酸、細胞膜透性和光合速率4個指標進行相關(guān)性分析如表1所示。

簡單相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，光合速率與丙二醛、細胞膜透性呈負相關(guān)關(guān)系，且達到極顯著差異水平，而與葉綠素呈正相關(guān);細胞膜透性與丙二醛、脯氨酸呈正相關(guān)性，且達到極顯著差異水平。說明低鹽脅迫下，植株細胞聚集大量的丙二醛，細胞膜透性受傷害程度加劇，從而造成光合速率下降;而脯氨酸作為小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以緩解細胞滲透壓，維持細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而維持水稻植株葉片可以進行正常光合速率，使植株保持正常生命活動。

3 討論

通過對鹽脅迫影響的水稻與正常生長環(huán)境下水稻相對比，鹽脅迫的水稻出現(xiàn)幾個特征。

（1）葉綠素是重要的光合作用物質(zhì)，其含量在一定程度上反映植物光合作用的強度，并影響植物的正常生長[15]。本研究中，鹽脅迫處理下5個水稻品種的葉綠素含量均下降，并且相差達到了2倍。并且不同海水稻出現(xiàn)黃葉，部分葉片出現(xiàn)衰老死亡現(xiàn)象，其中IR29品種枯死葉片較多。說明鹽脅迫阻礙水稻葉片葉綠素的正常合成。在鹽脅迫處理下，葉綠體中的鈉離子和氯離子增高，使得葉綠素和葉綠體蛋白間的結(jié)合變得松弛[16]，阻礙葉綠素合成與光合作用。同時葉綠素合成受阻導致水稻光合速率下降以及生育期延后。

（2）光合速率是反映植物耐鹽性的一個重要生理指標，而且其強弱直接影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。5個海水稻中，pokkali光合速率相對于其他4個種質(zhì)較強，HH11和R15A14兩種海水稻的光合速率與Pokkali品種較為接近。從王仁雷和華春所研究的結(jié)論得知，鹽脅迫下水稻葉綠體中鈉離子和氯離子積累導致葉片凈光合速率下降。鹽脅迫對水稻光合速率影響主要與葉片中鈉離子和氯離子的增加有關(guān)[17]。說明可能低鹽脅迫下這3個海水稻葉片中鈉離子和氯離子相對積累較少，受鹽害的影響較小，能夠保持穩(wěn)定的產(chǎn)量。

（3）在鹽脅迫下，植物通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)用于調(diào)節(jié)滲透平衡[18]。研究結(jié)果表明，在鹽脅迫下HH11種質(zhì)體內(nèi)游離脯氨酸的積累最多。而其他4種海水稻變化較小，HH11體內(nèi)累積大量的脯氨酸是調(diào)節(jié)滲透平衡有效途徑，增強了抗鹽害的能力。這與赫買良研究脯氨酸累積與植物耐鹽性[19]一文結(jié)論一致。

（4）鹽脅迫使得植物部分組織遭到破壞，水稻體內(nèi)丙二醛含量增加，導致細胞膜脂質(zhì)過氧化增強。細胞膜透性可反映植物葉片細胞膜的完整性及其受到傷害的程度，在正常的生長條件下，植物的質(zhì)膜透性均較小[20]。細胞質(zhì)膜不僅是分隔細胞內(nèi)與細胞的屏障，同時也是細胞與環(huán)境進行物質(zhì)交換的主要通道，也是細胞感受環(huán)境最敏感的部位[21-22]。質(zhì)膜透性改變標志著膜結(jié)構(gòu)與功能的變化[23]。鹽脅迫下不同海水稻體內(nèi)丙二醛的積累維持在較高水平，而水稻膜透性的也明顯增加。說明隨著丙二醛的積累，造成質(zhì)膜透性改變，以及膜結(jié)構(gòu)紊亂功能喪失，也標志著膜結(jié)構(gòu)與功能的變化，丙二醛的積累與脂膜過氧化程度之間呈現(xiàn)正相關(guān)。根據(jù)方差分析鹽脅迫組5個水稻品種的細胞膜透性得出，HH11與FLA78細胞膜透性呈現(xiàn)顯著性相關(guān)，兩個水稻品種細胞膜受傷害的程度較大，而R15A14、Pokkali細胞膜透性受鹽脅迫的影響相對較小，因此說明R15A14、Pokkali抗鹽脅迫的能力相對較強。

綜上，水稻耐鹽性是多基因控制作用的結(jié)果，機理復雜，在對多指標進行測定基礎上對材料特性進行綜合評價的方法，應用于水稻耐鹽育種的研究，可大大提高水稻耐鹽性篩選的可靠性。低鹽脅迫下植株細胞聚集大量的丙二醛，細胞膜透性受傷害程度加劇，從而造成光合速率下降;而脯氨酸作為小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以緩解細胞滲透壓，維持細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而維持水稻植株葉片可以進行正常光合速率，植株保持正常生命活動。HH11、R15A14具有顯著抗鹽脅迫能力，最終篩選HH11、R15A14這2個海水稻種質(zhì)，適合在鹽堿地進行規(guī)模種植。

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