肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的維持及模擬失重條件下鈣穩(wěn)態(tài)的改變

余 蕾， 趙雪紅， 張靜姝， 樊小力， 李雪萍， 朱娟霞

(1. 西安醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 西安 710021； 2. 湖北文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)部， 襄陽 441053； 3. 西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)部， 西安 710016)

Ca2+作為第二信使參與了肌肉收縮、腺體分泌、突觸傳遞、受精、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等眾多生命活動(dòng)的基本過程。正常的肌肉收縮即由Ca2+觸發(fā)。細(xì)胞處于安靜狀態(tài)時(shí)，胞漿[Ca2+]i低于0.1 μmol/L，肌肉舒張；當(dāng)肌細(xì)胞受到刺激興奮時(shí)，肌質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，胞漿[Ca2+]i迅速增加10～100倍，啟動(dòng)了興奮-收縮耦聯(lián)，Ca2+與肌鈣蛋白結(jié)合，觸發(fā)肌肉蛋白質(zhì)構(gòu)型改變，引起肌肉收縮；當(dāng)興奮終止時(shí)，肌質(zhì)網(wǎng)上的鈣泵水解ATP提供能量將胞漿中增多的Ca2+主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)回肌質(zhì)網(wǎng)，胞漿Ca2+濃度恢復(fù)正常，肌肉松弛。由此可見，鈣穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)肌肉收縮功能具有重要作用。

Ca2+參與肌細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)，肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+極可能參與了細(xì)胞增殖的啟動(dòng)過程。在Ca2+作用下，c-myc，c-fos及細(xì)胞膜受體表達(dá)增多，肌細(xì)胞有絲分裂明顯增加，肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉積，繼而出現(xiàn)肌細(xì)胞肥大、增生。受其影響，還出現(xiàn)了肌細(xì)胞蛋白表型轉(zhuǎn)換和幼稚型骨骼肌的生長(zhǎng)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，模擬失重條件下骨骼肌細(xì)胞出現(xiàn)的肌球蛋白表型的轉(zhuǎn)換、收縮功能減弱等情況均與骨骼肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)[2-4]。本文針對(duì)鈣穩(wěn)態(tài)的維持及模擬失重條件下的鈣穩(wěn)態(tài)失衡與肌萎縮的關(guān)系及其可能的機(jī)制進(jìn)行了綜述。

1 鈣穩(wěn)態(tài)的維持

細(xì)胞內(nèi)的鈣包括結(jié)合鈣、游離鈣兩部分，游離鈣大部分為Ca2+。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度約為1.5 mmol/L，其中胞漿內(nèi)的游離Ca2+濃度僅占0.01%。安靜狀態(tài)下的肌細(xì)胞胞漿中Ca2+濃度約為0.1 μmol/L。肌質(zhì)網(wǎng)、線粒體等具有貯存Ca2+的能力，被稱為鈣庫。鈣庫中的Ca2+濃度高于胞漿，以肌質(zhì)網(wǎng)為例，肌質(zhì)網(wǎng)中游離Ca2+濃度約為胞漿的5倍。

胞漿Ca2+濃度的調(diào)節(jié)可通過以下途徑完成：胞外Ca2+通過電壓門控鈣通道、配體門控鈣通道等離子通道進(jìn)入胞內(nèi)，使胞漿Ca2+濃度增高；胞內(nèi)鈣庫釋放鈣。鈣庫表面存在著鈣轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，能夠攝取及釋放Ca2+，對(duì)肌細(xì)胞胞漿鈣濃度的調(diào)節(jié)起著重要作用。本文重點(diǎn)討論鈣庫對(duì)胞漿Ca2+濃度的調(diào)節(jié)。

1.1 肌質(zhì)網(wǎng)對(duì)胞漿Ca2+濃度的調(diào)節(jié)

骨骼肌收縮時(shí)所需要的游離鈣大部分是由肌質(zhì)網(wǎng)釋放到胞漿中的。Ca2+通過肌質(zhì)網(wǎng)上的雷尼定受體(ryanodine receptor, RyR)快速釋放到胞漿中，引起肌肉收縮；而后又通過肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)由胞漿泵回肌質(zhì)網(wǎng)，引起肌肉舒張。

RyR受體是肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放通道。它位于肌質(zhì)網(wǎng)膜上，是一種跨膜蛋白，其C端構(gòu)成了Ca2+通道，N端可與胞漿中Ca2+結(jié)合。RyR受體有3種亞型：RyR1和RyR2主要存在于骨骼肌和心肌，在興奮-收縮耦聯(lián)過程中起核心作用；RyR3在骨骼肌中呈較低水平表達(dá)，其具體作用不詳。以上3種亞型在哺乳動(dòng)物腦中均有表達(dá)[5]。肌細(xì)胞受到刺激興奮時(shí)，T管膜上L型鈣通道構(gòu)象發(fā)生改變，繼而引發(fā)RyR1受體通道開放，觸發(fā)肌質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+。胞漿Ca2+可調(diào)節(jié)RyR受體的開放狀態(tài)，且具有雙向性：當(dāng)胞漿Ca2+濃度為1～10 μmol/L時(shí)，Ca2+促進(jìn)RyR1的開放；而當(dāng)胞漿Ca2+濃度增多至1～10 mmol/L時(shí)，則抑制RyR1的開放[6]。FK506binding-protein12(FKBP12)是RyR受體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定蛋白，cAMP可通過激活蛋白激酶A(protein kinases A，PKA)進(jìn)而磷酸化RyR，從而使FKBP12從RyR受體上脫離，RyR構(gòu)象改變，這時(shí)即便肌質(zhì)網(wǎng)處于靜息狀態(tài)，RyR也會(huì)向細(xì)胞漿泄漏大量的Ca2+[7]。磷酸二脂酶(phosphodiesterase ，PDEs)同工酶超家族成員之一PDE4則可通過分解細(xì)胞內(nèi)cAMP維持RyR受體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。亞硝基化可使RyR受體性質(zhì)發(fā)生改變，F(xiàn)KBP12表達(dá)減少，從而使RyR受體通道開放次數(shù)增多，胞內(nèi)靜息Ca2+濃度增加，肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+耗竭，肌肉收縮時(shí)表現(xiàn)為肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放減少，肌肉收縮力減弱[8]。

肌質(zhì)網(wǎng)攝取Ca2+主要通過SERCA實(shí)現(xiàn)。SERCA位于肌質(zhì)網(wǎng)膜上，是一種四聚體陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶，它能夠水解ATP產(chǎn)生能量，從而將胞漿內(nèi)的Ca2+主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)回肌質(zhì)網(wǎng)。SERCA存在3種亞型，其中SERCA1主要在成年骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)，它又包括1a和1b兩種亞型，前者主要在快肌纖維中高表達(dá)，后者主要在慢肌纖維中高表達(dá)。SERCA2則常見于心肌和骨骼肌慢肌纖維中[9]。

1.2 線粒體對(duì)胞漿Ca2+的調(diào)節(jié)

細(xì)胞約有50% Ca2+儲(chǔ)存在線粒體中，線粒體通過與Ca2+的結(jié)合，完成了氧化磷酸化過程，為肌肉活動(dòng)提供所需能量。線粒體在胞漿Ca2+濃度的調(diào)節(jié)過程中扮演著重要角色，線粒體既能從胞漿攝取Ca2+，也能將其內(nèi)部?jī)?chǔ)存的Ca2+釋放至胞漿。然而在生理?xiàng)l件下線粒體對(duì)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的維持僅起輔助作用[10]。線粒體內(nèi)膜上存在有線粒體Ca2+單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和線粒體Ca2+攝入蛋白1，它們都參與了線粒體對(duì)胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)過程。當(dāng)胞漿Ca2+濃度異常增高時(shí)，胞漿內(nèi)的Ca2+可借助線粒體Ca2+單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白順電化學(xué)梯度快速轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，引起線粒體內(nèi)Ca2+聚集；線粒體內(nèi)的Ca2+可通過鈉鈣交換轉(zhuǎn)出進(jìn)入胞漿[11]。線粒體Ca2+攝入蛋白1還參與了SAH介導(dǎo)的鈣超載[12]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制線粒體Ca2+單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，可減弱由Ca2+觸發(fā)的細(xì)胞凋亡[13]。

2 模擬失重條件下鈣穩(wěn)態(tài)的改變及其對(duì)肌細(xì)胞的影響

Ca2+在細(xì)胞外液、胞漿、鈣庫之間不斷移動(dòng)，并在各部分維持著相對(duì)穩(wěn)定的濃度，這便是鈣穩(wěn)態(tài)。鈣穩(wěn)態(tài)的維持涉及一系列復(fù)雜的機(jī)制，它是細(xì)胞能完成一系列生理功能和Ca2+信號(hào)生成與轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高達(dá)到鈣超載時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣超載與多種組織的細(xì)胞損傷及修復(fù)密切相關(guān)，如心肌、神經(jīng)、肝臟等[15]。

以大鼠為研究對(duì)象進(jìn)行模擬失重研究發(fā)現(xiàn)，模擬失重僅3 d，梭內(nèi)、外肌細(xì)胞即出現(xiàn)了胞漿游離Ca2+濃度增多的現(xiàn)象；模擬失重14 d，梭內(nèi)、外肌細(xì)胞胞漿出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象，并可見到梭內(nèi)肌纖維中鈣結(jié)合蛋白D28K的表達(dá)明顯減少，D28K與胞漿游離Ca2+的結(jié)合減弱，胞漿游離Ca2+增多，細(xì)胞抵抗鈣超載的毒性作用減弱。說明模擬失重條件下肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+異常增多，且隨模擬失重時(shí)間的延長(zhǎng)而加重[3]。近期又有研究表明[15-16]，模擬失重時(shí)間超過4周，骨骼肌細(xì)胞RyR1 mRNA呈低表達(dá)，而肌質(zhì)網(wǎng)SERCA活性及表達(dá)則顯著增加，說明在長(zhǎng)期模擬失重狀態(tài)下，肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+釋放減少而肌質(zhì)網(wǎng)對(duì)胞漿Ca2+的攝取增多，提示隨著模擬失重時(shí)間的延長(zhǎng)，超載的Ca2+由胞漿向肌質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移。

Ingalls等[17]發(fā)現(xiàn)，模擬失重7 d可引起骨骼肌線粒體鈣超載，肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵活性降低，肌質(zhì)網(wǎng)攝取Ca2+明顯減少，從而導(dǎo)致胞漿Ca2+大量堆積，肌肉收縮力減弱。在大鼠尾部懸吊動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，吊尾第2天細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高38%，至第7天時(shí)升高117%，而肌肉的最大等長(zhǎng)收縮力(P0)則分別下降24%和27%。研究資料表明，在失重狀態(tài)下，骨骼肌的等長(zhǎng)收縮持續(xù)時(shí)間減少，間斷強(qiáng)直收縮的舒張時(shí)程、峰張力時(shí)間和半舒張時(shí)間減小，這與肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放和再攝取的數(shù)量與速度的改變有關(guān)，若提高肌質(zhì)網(wǎng)釋放和再攝取Ca2+的速率，則可提高肌肉的工作能力[18]。

模擬失重條件下，肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高的同時(shí)，伴隨著c-fos表達(dá)的顯著增高和肌球蛋白重鏈亞型的轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為IIa型肌球蛋白重鏈表達(dá)降低，而IIb型、IIx型肌球蛋白重鏈表達(dá)升高，推測(cè)胞內(nèi)Ca2+濃度增加啟動(dòng)了c-fos的高表達(dá)，從而引起了肌球蛋白表型的轉(zhuǎn)換[1,19]。胞外Ca2+內(nèi)流增多或胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+所致的細(xì)胞胞漿Ca2+濃度異常增高，均可引發(fā)肌纖維的損傷，啟動(dòng)肌肉蛋白的分解。僅依靠肌質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+所致的胞內(nèi)鈣超載就可使肌肉收縮功能減退、甚至引起肌肉損傷。且Ca2+內(nèi)流產(chǎn)生了肌梭電位、并觸發(fā)了肌梭初級(jí)末梢釋放遞質(zhì)，維持了感覺末梢的興奮性，可見Ca2+與肌梭功能密切相關(guān)。據(jù)此我們認(rèn)為，在失重/模擬失重環(huán)境下，梭內(nèi)肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡或鈣超載必然影響肌梭電位的產(chǎn)生，從而使肌梭傳向中樞的沖動(dòng)減少，肌緊張減弱，最終將導(dǎo)致或者加重肌肉萎縮。

3 模擬失重條件下鈣穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致肌肉萎縮的可能機(jī)制

3.1 水解蛋白質(zhì)。高濃度Ca2+可激活Ca2+-依賴性的蛋白水解酶Calpains，從而引起肌細(xì)胞蛋白質(zhì)降解。Calpains存在兩種主要亞型，即Calpain-1(μ-Calpain)和 Calpain-2(m-Calpain)，且在骨骼肌Z線上呈現(xiàn)出密集分布。肌原纖維用Ca2+處理后可見到Z線被快速而完全的裂解[20]。胞內(nèi)Ca2+濃度增加可通過激活Calpain-1，水解結(jié)蛋白、原肌球蛋白、肌聯(lián)蛋白等肌原纖維蛋白。此外Calpain-1還可水解親聯(lián)蛋白，使得肌質(zhì)網(wǎng)膜與T管連接的穩(wěn)定性減弱，肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放減少，最終導(dǎo)致肌細(xì)胞收縮功能下降、結(jié)構(gòu)破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[21-22]。梭內(nèi)肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加可通過激活Calpains而降解細(xì)肌絲的肌動(dòng)蛋白，使橫橋無法與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，肌肉無法收縮，從而導(dǎo)致梭內(nèi)肌萎縮、收縮蛋白含量降低。研究發(fā)現(xiàn)，后肢去負(fù)荷5 d即可導(dǎo)致大鼠比目魚肌細(xì)胞胞漿鈣超載，且隨著去負(fù)荷時(shí)間的延長(zhǎng)，Calpain-1的活性及結(jié)蛋白降解逐漸增加，相鄰肌原纖維的連接逐漸松散[23]。

3.2 線粒體功能障礙。細(xì)胞內(nèi)鈣超載可加強(qiáng)肌質(zhì)網(wǎng)和線粒體對(duì)Ca2+的攝取，鈣依賴性的ATP酶活動(dòng)增多，從而使ATP的消耗增加；同時(shí)，線粒體攝取Ca2+后，Ca2+與線粒體內(nèi)富含磷酸根的化合物相互作用形成磷酸鈣沉積，影響ATP的合成[24]。ATP的合成不足和消耗增加，最終導(dǎo)致肌細(xì)胞收縮功能障礙。Ca2+超載情況下，鈣依賴性磷脂酶被激活，水解生物膜中的磷脂骨架，增加了膜的通透性，進(jìn)一步加劇了鈣超載；同時(shí)，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔大量開放，線粒體釋放細(xì)胞色素C，Caspase-9、Caspase-3相繼激活，啟動(dòng)了線粒體凋亡程序[25-27]。由此可見，高鈣可引發(fā)線粒體功能障礙甚至導(dǎo)致線粒體凋亡。

圖1 模擬失重條件下鈣穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致肌肉萎縮的可能機(jī)制的示意圖

3.3 誘發(fā)凋亡。鈣超載時(shí)可激活黃嘌呤代謝途徑，產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基增多又可通過促進(jìn)RyR受體通道開放而加重鈣超載，并通過調(diào)節(jié)Bax與Bcl-2的比例而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[28-29]。Calpain-1、Caspase-3、促凋亡因子Bid可被細(xì)胞內(nèi)增多的Ca2+相繼激活，繼而引發(fā)Caspase-12降解，并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。大鼠尾部懸吊2周即可出現(xiàn)Calpain-1與Calpain-2活性的增加，兩者活性分別增加了1.5倍和4.3倍[29-30]。Calpastatin是一種內(nèi)生的Calpain抑制劑，可抑制Calpain-1和Calpain-2的活性。Calpastatin過表達(dá)時(shí)，后肢去負(fù)荷10 d的大鼠肌肉萎縮程度減少30%，肌球蛋白亞型由慢向快的轉(zhuǎn)變減少[28]。

4 結(jié)論

綜上所述，肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的維持為肌肉收縮舒張功能的實(shí)現(xiàn)提供了保障，骨骼肌細(xì)胞胞漿鈣穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，尤其是胞漿Ca2+濃度過度增加或持續(xù)性增加，可通過激活磷脂酶水解生物膜的骨架成分，增加生物膜的通透性；同時(shí)通過激活半胱氨酸蛋白酶Calpain水解蛋白質(zhì)，引發(fā)肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，從而影響肌肉的收縮與舒張功能。Ca2+濃度增加還可以激活細(xì)胞內(nèi)溶酶體系統(tǒng)，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)降解[28]。據(jù)此推斷，失重/模擬失重條件下產(chǎn)生的鈣超載可能是失重性肌萎縮發(fā)生的重要原因，鈣超載通過破壞梭內(nèi)外肌纖維結(jié)構(gòu)而影響肌肉收縮功能，同時(shí)通過影響肌梭電位的產(chǎn)生，使肌梭傳向中樞的沖動(dòng)減少，肌緊張減弱，最終將導(dǎo)致或者加重肌肉萎縮。