大鼠腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎損傷后再生的初步研究

唐學(xué)敏 左金華 丁長玲 朱玉紅 王晶 宋冰 毛玉龍

為了研究腮腺組織的再生能力[1]，本課題組采用了大鼠腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎再通的模型[2]，觀察其在不同時間的結(jié)扎損傷后腮腺組織的再生能力，并初步探討其機(jī)制，為臨床研究由于慢性涎腺炎、舍格倫綜合征、以及頭面部放射治療后引起的唾液分泌功能障礙疾病提供理論依據(jù)。目前治療唾液腺機(jī)能減退的方法主要是刺激殘余唾液腺的分泌能力和人工唾液代替，然而這些方法只能提供臨時的作用不能恢復(fù)腺體的功能[3]。涎腺再生技術(shù)為各類原因?qū)е碌南严俟δ苷系K提供了新的治療觀念，再生機(jī)制的研究也成近幾年研究的熱點[4]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HE試劑盒、AB-PAS試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；一抗：PDCD5多克隆抗體(兔抗大鼠)、AQP5多克隆抗體(兔抗大鼠)、二抗：山羊抗兔(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，其余試劑購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 動物模型

8 周齡Wistar大鼠54 只，隨機(jī)分成9 組，每組6 只，4%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射麻醉下分離出腮腺主導(dǎo)管用3號絲線將導(dǎo)管結(jié)扎于1 mm鋼絲，于結(jié)扎第7天再通，分別取再通后的第0、3、5、7、10、14、21、28 d的腮腺組織，部分用福爾馬林固定制作蠟塊，用于HE染色和AB-PAS染色；部分冷藏于-80 ℃冰箱做Western blot實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 HE染色和AB-PAS染色 各組腮腺組織在福爾馬林固定24 h，經(jīng)逐級脫水制成蠟塊，切成4 μm厚的切片，經(jīng)脫蠟后染色，分別按照試劑盒說明書操作。觀察腮腺導(dǎo)管再通后腮腺組織鏡下的形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2 Western blot實驗 將冷藏于-80 ℃的腮腺組織取80 g加入裂解液研磨，嚴(yán)格按說明書操作步驟測量蛋白濃度,將30 μg蛋白上樣于10%SDS凝膠，恒壓80 V 50 min,恒壓100 V 50 min，電泳結(jié)束后，恒流250 mA 1 h，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，PDCD5和AQP5一抗孵育，4 ℃過夜，TBST洗滌3 遍后，二抗室溫下?lián)u床孵育1 h，TBST洗滌3 遍后，經(jīng)曝光檢測目的蛋白的表達(dá)，GAPDH對照組，實驗重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

大鼠腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎再通的模型構(gòu)建成功，主導(dǎo)管結(jié)扎后腮腺組織萎縮，微觀結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為腺泡細(xì)胞減少，導(dǎo)管系統(tǒng)擴(kuò)張，導(dǎo)管再通后腺體形態(tài)逐漸恢復(fù)，腺泡細(xì)胞增多，導(dǎo)管系統(tǒng)萎縮，腺體功能逐漸恢復(fù)。

HE染色結(jié)果：對照組腺泡細(xì)胞緊密排列，占腺小葉的大部分，導(dǎo)管分布均勻，占腺小葉的小部分，閏管、紋管、分泌管大小形態(tài)明顯容易分辨。再通0 d腮腺組織，腺泡細(xì)胞減少明顯，鏡下有少量殘存腺泡細(xì)胞，炎癥細(xì)胞明顯；再通1 d腮腺組織腺泡細(xì)胞有增生的現(xiàn)象，導(dǎo)管萎縮不明顯；再通3 d的腺泡細(xì)胞明顯增多，導(dǎo)管萎縮明顯，視野內(nèi)腺泡細(xì)胞與導(dǎo)管的比例增大；再通7 d組織腺泡細(xì)胞明顯增多，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)較少；再通14 d組織，與正常對照組差別基本不大，腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管基本恢復(fù)至正常水平，炎癥細(xì)胞顯著減少，腺泡排列緊密，導(dǎo)管形態(tài)較清晰。再通21 d和28 d組織鏡下與正常組無差別，腺小葉及導(dǎo)管形態(tài)與正常組一致。結(jié)果如圖 1。

AB-PAS結(jié)果：對照組見腺泡細(xì)胞內(nèi)豐富的紫紅色顆粒，導(dǎo)管內(nèi)可見部分有紫紅染色。再通0 d可見腺泡內(nèi)紫紅色顆粒減少，導(dǎo)管內(nèi)幾乎未見紫紅染色，再通3 d紫紅色顆粒明顯增多，導(dǎo)管內(nèi)鮮有紫紅染色；再通7 d組，腺泡細(xì)胞豐富，紫紅色顆粒豐富，導(dǎo)管內(nèi)有較少的紫紅色顆粒。再通14 d組鏡下腺泡與再通21 d、28 d及正常組無明顯差別，導(dǎo)管內(nèi)可見有紫紅色分泌顆粒。結(jié)果如圖 2。

圖 1 大鼠腮腺組織再通后不同時間點組織形態(tài) (HE, ×200)

Western blot結(jié)果顯示：AQP5蛋白表達(dá)逐漸增多趨勢，至再通第7天時與對照組無明顯差別，PDCD5蛋白表現(xiàn)為先增多后減少最后趨于穩(wěn)定的趨勢，第3天時達(dá)到最多，第10天后表達(dá)趨于穩(wěn)定(圖 3)。

3 討 論

涎腺損傷的模型主要有腮腺導(dǎo)管結(jié)扎、涎腺輻射模型等，對于研究慢性涎腺炎、舍格倫綜合征等腺體功能降低的疾病采用導(dǎo)管結(jié)扎的模型較多，Tamarin等[5]通過絲線直接結(jié)扎的方法將導(dǎo)管阻塞，Miyazaki[6]采用一種小鑷子，鈍性分離出腮腺主導(dǎo)管將導(dǎo)管夾住，達(dá)到結(jié)扎的目的。Maria等[7]采用3號絲線雙結(jié)扎的方法結(jié)扎兔頜下腺主導(dǎo)管。Burford-Mason 采用一種微型的夾子，夾子呈V形，兩臂長15 mm的不銹鋼絲嵌入一個聚乙烯管的套筒中，通過顯微手術(shù)將夾子放置在導(dǎo)管上，夾子的兩臂緊緊的夾在一起，直到夾子不能沿著導(dǎo)管方向來回移動。本實驗采用3號絲線將鈍性分離后的導(dǎo)管結(jié)扎于直徑1 mm的鋼絲上，按時間將絲線及鋼絲去除，結(jié)果顯示結(jié)扎后腺體萎縮，再通后腺體再生，且通過HE、AB-PAS染色及Western blot分析顯示，結(jié)扎7 d再通后腺體14 d后可基本恢復(fù)至正常，實驗結(jié)果顯示大鼠腮腺腺泡形態(tài)恢復(fù)的同時，其分泌功能也恢復(fù)。

圖 2 大鼠腮腺組織再通后不同時間點AB-PS染色

圖 3 大鼠腮腺主導(dǎo)管再通后不同時間點AQP5和PDCD5的表達(dá)

AQP5是一族廣泛存在于原核和真核細(xì)胞膜上選擇性高效轉(zhuǎn)運水分子的特異性通道，AQP5表達(dá)于上皮的頂質(zhì)膜，在AQP5敲除的小鼠，匹洛卡品刺激的唾液分泌顯著減少[8]，唾液粘稠高鹽，表明腺泡上皮頂質(zhì)膜是唾液分泌的限速部位，AQP5的表達(dá)結(jié)果與PAS染色結(jié)果均顯示導(dǎo)管再通第14天時腺體的形態(tài)及分泌功能恢復(fù)至正常水平，其形態(tài)恢復(fù)的同時，腺泡的分泌功能也同時恢復(fù)。PDCD5是凋亡的正調(diào)節(jié)分子，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能，在正常的腮腺組織中低表達(dá)，腮腺主導(dǎo)管再通0 d時由于腺泡細(xì)胞的凋亡PDCD5出現(xiàn)高表達(dá)，再通3 d時由于導(dǎo)管細(xì)胞的迅速凋亡，PDCD5出現(xiàn)表達(dá)的增多。實驗結(jié)果說明腮腺導(dǎo)管再通后萎縮的腺體形態(tài)和功能都可基本恢復(fù)，腮腺主導(dǎo)管再通后擴(kuò)張的導(dǎo)管系統(tǒng)由于失去了外在壓力，增生的導(dǎo)管迅速凋亡，逐漸恢復(fù)至正常水平。

腮腺組織再生的腺泡細(xì)胞來源是近年來學(xué)者爭論的焦點，Man等[9]認(rèn)為位于閏管的干細(xì)胞是涎腺中所有細(xì)胞類型的來源。而Aure等[10]則通過示蹤標(biāo)記的干細(xì)胞6 個月發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞的數(shù)量沒有明顯減少，因此他認(rèn)為腺泡細(xì)胞數(shù)量的維持是由自身復(fù)制而來，干細(xì)胞的作用不大。Cotroneo等[11]認(rèn)為再生的腺泡細(xì)胞是由于激活了殘存導(dǎo)管中的干細(xì)胞分化而來。盧浩等[12]認(rèn)為能夠抵抗凋亡的腺泡細(xì)胞是再生腺泡的組織來源。Lombaert等[13]通過細(xì)胞家系追蹤發(fā)現(xiàn)祖細(xì)胞群在胚胎時期能夠分化成各類細(xì)胞，但在出生后的腺體未發(fā)現(xiàn)有明顯證據(jù)。Rugle-Stahl等[14]通過研究干細(xì)胞表面因子Asc13發(fā)現(xiàn)分離出的成熟腺體中表達(dá)Asc13的細(xì)胞能夠在試管中分化成腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞，但在活體內(nèi)未被證實。Sugito等[15]通過將體外培養(yǎng)的涎腺上皮細(xì)胞移植到大鼠正常頜下腺和再生過程中的頜下腺中發(fā)現(xiàn)在生長中的頜下腺中可以存活4 周，而在正常頜下腺不能存活，因此他認(rèn)為細(xì)胞的吸附和存活很大程度上依賴于腺體的內(nèi)環(huán)境。Nair等[16]研究發(fā)現(xiàn)涎腺的功能恢復(fù)是多種因素綜合作用的結(jié)果，多能干細(xì)胞在涎腺發(fā)育和再生過程中有促進(jìn)分化的潛力。Ogawa等[17]認(rèn)為幾乎所有的器官都起源于上皮和間充質(zhì)細(xì)胞，通過生物工程再造的技術(shù)可以準(zhǔn)確地在試管內(nèi)再生腺體。依據(jù)本實驗的結(jié)果作者認(rèn)為腮腺組織具有損傷后再生的能力，結(jié)扎7 d的腮腺組織再通后可恢復(fù)其形態(tài)與功能，表明腮腺組織在受到一定的損傷程度內(nèi)可恢復(fù)至正常，但更嚴(yán)重的損傷是否能夠恢復(fù)以及再生的腮腺組織來源于何處有待進(jìn)一步的研究。