甜菜堿對大鼠心肌缺血再灌注損傷炎癥及心肌細(xì)胞凋亡的影響

向家培 華曉芳 王 勇 劉長召 雷玉華

再灌注治療是治療心肌梗死最有效的方法，然而再灌注在挽救缺血心肌時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致部分缺血心肌甚至正常心肌損傷，這種現(xiàn)象稱為缺血再灌注(ischemia andreperfusion,IR)損傷。有研究[1]表明，阻斷心肌血流，可以造成局部心肌70%的梗死，單純給予再灌注治療而不預(yù)防再灌注損傷可以將心梗面積從70%降到30%，而給予有效措施抑制再灌注損傷，可以將心梗面積從30%降低到5%，進(jìn)一步挽救25%的心肌。因此如何預(yù)防和減輕心肌IR損傷，已經(jīng)成為治療心肌梗死的重要課題。甜菜堿作為一種食物來源的磷脂酰膽堿代謝產(chǎn)物，是腸道菌群影響心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要介質(zhì)之一[2]。近年研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，甜菜堿可以抑制大鼠心梗模型中，細(xì)胞間粘附因子和單核細(xì)胞趨化蛋白1等炎癥因子的表達(dá)。而炎癥是IR損傷的重要機(jī)制之一，抑制炎癥可以抑制心肌凋亡，顯著減輕IR損傷[5]。高遷移率族蛋白1(high mobility group protein box 1，HMGB1)-白介素17A(interleukin-17A，IL-17A)-白介素6(interleukin-6，IL-6)炎癥軸被證實(shí)在心肌IR損傷中發(fā)揮重要作用，可以通過誘導(dǎo)炎癥瀑布樣反應(yīng)以及心肌細(xì)胞凋亡加重心肌IR損傷[6-7]。而甜菜堿是否可調(diào)節(jié)此炎癥軸，以及甜菜堿對心肌IR中心肌細(xì)胞凋亡的影響尚無相關(guān)研究。因此，本研究擬通過大鼠IR模型，探討甜菜堿對大鼠心肌IR的中炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取18只SPF級成年雄性SD大鼠，均購于武漢大學(xué)動(dòng)物中心，體質(zhì)量200～250 g，于恒溫、恒濕環(huán)境飼養(yǎng)48 h，大鼠可自由獲取食物和水。

1.2 試劑和儀器 戊巴比妥鈉(德國Merck Drugs & Biotechnology)；小動(dòng)物人工呼吸機(jī)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；離心機(jī)(TDZ5-W8臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶b(creatineKinase-MB，CK-Mb)和肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)( 南京建成生物工程研究所試劑盒)；高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)，白介素17A(interleukin-17 A，IL-17A),白介素6(interleukin-6，IL-6)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(武漢華美生物工程有限公司Elisa試劑盒)；5×蛋白上樣緩沖液( 中國阿斯本生物公司)； 12%SDS-PAGE分離膠[ 蒸餾水3.3 mL，30%丙烯酰胺(29∶1)4 mL，1.5M Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL；10%SDS 0.1 mL；過硫酸銨0.1 mL，TEMED 5 μL]；5%濃縮膠[ 蒸餾水4 mL，30%丙烯酰胺(29∶1)1 mL，1M Tris-HCl(pH 6.8)1 mL；10%SDS 80 μL；過硫酸銨60μL，TEMED 8μL]；抗活化的caspase-3( 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司 1∶100稀釋)； Bcl-2( 美國santa公司，1∶500稀釋)；Bax( 美國bioword公司，1∶800稀釋)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗大鼠抗體( 中國阿斯本生物公司，1∶10 000稀釋)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將18只大鼠分為3組：假手術(shù)組(SO組)，缺血再灌注組(IR組)和甜菜堿組(西亞試劑)，每組各6只大鼠。

1.3 方法 SO組和IR組于造模前1 h給予生理鹽水(10 mL/kg)灌胃， 甜菜堿組造模前1 h給予甜菜堿(450 mg/kg)溶于生理鹽水(10 mL/kg)灌胃。2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，仰臥位固定于鼠板上，氣管插管(頻率70 次/分，吸呼比1∶1.5，潮氣量3～4 mL/100 g)，胸骨左緣剪開皮膚，分離肌肉，斷第2和3肋，暴露心臟，SO組在左心耳下緣2～3 mm處將前降支下穿線不結(jié)扎，等待4.5 h后取頸靜脈血和心尖部心肌組織。IR組和甜菜堿組將前降支與一中空帶凹槽橡皮管結(jié)扎，30 min后剪斷結(jié)扎線再灌注4 h。再灌注后，經(jīng)頸靜脈取血2 mL，迅速剪下心臟，取心梗和缺血區(qū)(心尖部變白的心肌)，生理鹽水沖洗后凍于-80℃冰箱。比較3組大鼠心肌損傷標(biāo)記物(LDH、CK-Mb、cTnI)，炎癥因子(HMGB1、IL-17A、IL-6、TNF-α)和凋亡蛋白[活化的caspase-3，Bcl-2/Bax]的表達(dá)。

1.4 心肌損傷標(biāo)記物的檢測 采集頸靜脈血2 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清，檢測大鼠血清中心肌損傷標(biāo)記物L(fēng)DH、CK-Mb和cTnI。

1.5 炎癥因子的檢測 采用ELISA法檢測大鼠心肌組織中炎癥因子HMGB1、IL-17A、IL-6和TNF-α表達(dá)。嚴(yán)格按照說明書操作。

1.6 凋亡蛋白的檢測 組織塊用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2～3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，振蕩。冰浴30 min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保勻漿液完全裂解。4℃13 000 g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。Western Blot 法檢測大鼠心肌組織凋亡蛋白活化的caspase-3，Bcl-2/Bax，評價(jià)心肌細(xì)胞凋亡水平。心肌組織勻漿后，取40 μg樣本，加入適量5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min。配制12%分離膠，5%濃縮膠，濃縮膠80 V，分離膠120 V恒壓電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間60 min，與一抗孵育過夜，與HRP-goat二抗，室溫孵育30 min后，ECL顯色。

1.7 觀察指標(biāo) 檢測并比較3組大鼠心肌損傷標(biāo)記物(LDH,CK-Mb,cTnI),炎癥因子和凋亡蛋白的水平。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心梗標(biāo)記物表達(dá)水平比較 IR組大鼠中心肌損傷標(biāo)記物CK，LDH和cTnI表達(dá)水平高于SO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。與IR組比較，甜菜堿組心肌損傷標(biāo)志物CK，LDH和cTnI的表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

2.2 3組大鼠炎癥因子表達(dá)水平比較 與SO組比較，IR組中心肌炎癥因子HMGB1、IL-17A、IL-6和TNF-α表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與IR組比較，甜菜堿組心肌炎癥因子HMGB1、IL-17A、IL-6和TNF-α的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

2.3 3組大鼠心肌凋亡蛋白表達(dá)水平 與SO組比較，IR組中凋亡蛋白活化的caspase-3的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Bcl-2/Bax的比值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與IR組比較，甜菜堿可以顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡，活化的caspase-3的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Bcl-2/Bax的比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表1 3組大鼠心肌損傷標(biāo)記物表達(dá)水平比較

注：與SO比較,#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

表2 3組大鼠炎癥因子表達(dá)水平比較

注：與SO組比較,#P<0.05；與IR組比較,*P<0.05

表3 3組大鼠凋亡蛋白表達(dá)水平比較

注：與SO組比較，#P<0.05；與IR組比較，*P<0.05

3 討論

甜菜堿作為一種甲基化的衍生物可以從多種食物中獲得，依靠腸道微生物代謝，在脊椎動(dòng)物體內(nèi)它不僅可以作為甲基供體，也參與維持機(jī)體滲透壓和穩(wěn)態(tài)。近年研究[5,8]發(fā)現(xiàn)，在異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌缺血的模型中，甜菜堿可以通過抑制心肌組織炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白1和細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)，減輕心肌組織的炎癥反應(yīng)和心肌損傷。

前期研究[9]證實(shí)，HMGB1為一種早期促炎因子，不僅可以直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，加重心肌IR損傷，也可以通過HMGB1-IL-17A-IL-6炎癥軸反應(yīng)，上調(diào)IL-17A，IL-6，TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥瀑布樣反應(yīng)，進(jìn)而加劇心肌IR損傷。Hu等[10]的研究證實(shí)，心肌IR損傷的程度與HMGB1的表達(dá)水平呈劑量依賴型，HMGB1的表達(dá)水平越高，心肌IR損傷越重，通過BNP后處理等方式抑制HMGB1的表達(dá)可以顯著抑制心肌IR損傷。可見HMGB1是心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵炎癥因子之一。有研究[8,11]證實(shí)，甜菜堿可以通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3調(diào)控下游IL-6，細(xì)胞間粘附因子等炎癥因子的表達(dá)。Ma等[5]研究證實(shí)，在大鼠心肌IR模型中，絲裂原活化蛋白激酶通路參與調(diào)控HMGB1的釋放。本研究發(fā)現(xiàn)，與IR組比較，甜菜堿組大鼠心肌組織中HMGB1、IL-17A、IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。提示甜菜堿可以顯著抑制大鼠心肌HMGB1以及下游炎癥因子IL-17A、IL-6和TNF-α的表達(dá)。筆者推測甜菜堿抑制作用可能與絲裂原活化蛋白激酶通路有關(guān)。但信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3通路以及是否有其他通路的參與甜菜堿對大鼠IR心肌損傷中炎癥反應(yīng)的調(diào)控過程尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制可以分為細(xì)胞外途徑和細(xì)胞內(nèi)途徑，且兩種途徑相互關(guān)聯(lián)和影響。炎癥因子可以激活細(xì)胞外凋亡途徑。多種炎癥因子與相應(yīng)的受體結(jié)合，誘導(dǎo)含死亡片段的蛋白聚集，激活凋亡蛋白激酶caspase-8和caspase-3引起細(xì)胞凋亡[12]。內(nèi)源性凋亡途徑也稱線粒體途徑，氧化應(yīng)激水平與此途徑激活緊密相關(guān)，過量活性氧產(chǎn)生激活Bcl-2家族蛋白，增加促凋亡蛋白Bax的分泌和轉(zhuǎn)移，通過與相應(yīng)受體結(jié)合促進(jìn)增加線粒體膜的通透性，誘導(dǎo)多種促凋亡蛋白，如細(xì)胞色素c，核酸內(nèi)切酶G和Smac/Diablo釋放，激活caspase-3和caspase-9，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與IR組比較，甜菜堿組活化的caspase-3表達(dá)水平顯著下降，Bcl-2/Bax比值顯著增加(P<0.05)。提示甜菜堿可以減輕大鼠心肌IR心肌細(xì)胞凋亡。此外甜菜堿為天然抗氧化劑，其是否可以通過抑制心肌IR中氧化應(yīng)激水平抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，筆者認(rèn)為甜菜堿可以通過抑制炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡，減輕大鼠心肌IR損傷。